著者

喜田 宏 河岡 義裕 WEBSTER R.G. 岡崎 克則 伊藤 寿啓 R.G.WEBSTER

出版者

北海道大学

雑誌

国際学術研究

巻号頁・発行日

1993

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平成3-4年度の文部省科学研究費・国際学術研究(0304103)および平成5年度の本研究による調査の結果、アメリカ合衆国アラスカ州中央部の湖沼に営巣する渡り鴨が、夏季にインフルエンザウイルスを高率に保有していることが判明した。平成6年度には前年度にひき続き、アラスカ州中央部のユコン平原にあるマラ-ド湖、ハート湖およびビッグミント湖で鴨の糞便材料を採取し、ウイルス分離試験を実施すると共に、湖水からのウイルス分離を試みた。さらに、分離ウイルスの抗原亜型を決定した上で、これまでに得られたウイルス株を加えて、分離年、分離地および亜型が異なるウイルスのNPおよびHA遺伝子の塩基配列を決定し、系統進化解析を行った。平成5年度および6年度に鴨の糞便541検体から分離されたインフルエンザウイルスは33株、パラミクンウイルスは15株であった。イルフルエンザウイルスの抗原亜型は、H3N8が23株、H4N6が8株、そしてH7N3が1株であった。文部省科学研究費により実施した平成3年および4年度の調査成績をあわせると、4年間に分離されたインフルエンザウイルスは108株で、その内訳は、H2N3が1株、H3N8が37株、H4N6が55株,H10N9が1株であった。従って、アラスカ中央部に夏季に営巣する鴨が多くの異なる抗原亜型のウイルスを維持していることならびに同じ営巣湖沼に異なる抗原亜型のインフルエンザウイルスが共循環していることが明らかとなった。また、鴨が夏季に巣を営み、ヒナを育てる湖沼の水からもインフルエンザウイルスが分離された。平成6年8月8日に採取したビッグミント湖の水13サンプルのうち7検体からインフルエンザウイルスが分離され、湖水1ml中のウイルス感染価は10^<1.8>-10^<2.8>EID_<50>におよんだ。そこで、ほとんどすべての鴨が渡りに飛び発った後、同年9月18日に再びビッグミント湖の水を採集して、ウイルス分離を試みた。その結果、H3N8およびH7N3ウイルスが得られた。その成績は、インフルエンザAウイルスが水鳥集団の間で受け継がれており、自然界におれるインフルエンザウイルスの存続には、冬期間の湖水中の凍結保存が関与するとの我々の推定を強く支持するものである。すなわち、北方の鴨の営巣湖沼がインフルエンザウイルスの貯蔵庫であり、秋(8月中旬)に鴨が渡りに飛び発つ前にその糞便と共に排泄したウイルスが冬期間凍結した湖沼水中に保存され、春に帰巣する鴨がこれを経口摂取して感染し、増殖することを毎年繰り返して存続してきたものと考えられる。これまでにアラスカで鴨の糞便が分離されたインフルエンザウイルス108株のうち、異なる年に異なる地点で分離されたウイルス18株のNP遺伝子および6株のH3ウイルスのHA遺伝子の塩基配列を決定し、系統進化解析を行った。成績から、アラスカ中央部に営巣する鴨の糞便から分離されたウイルスのNP遺伝子およびHA遺伝子は何れも北米大陸で分離されたウイルスと同じ系統に属し、アジアおよびヨーロッパで分離されたウイルスとは異なることが判明した。これらの成績は、少なくともユコン平原に営巣する鴨はアリューシャン列島を通ってアジアに飛来することは稀であることを示している。一方、このようにウイルス遺伝子を解析することによって、その宿主島の飛翔路を推定することが可能であることが判明した。先に研究代表者らは新型インフルエンザウイルスの起源が渡り鴨のウイルスにあって、アジア、特に中国南部で家鴨および豚がその出現に関与することを証明した。従って新型インフルエンザウイルスの予測のためには、南中国に飛来する渡り鴨およびその営巣湖沼を調査することが必須である。今後シベリアの鴨の営巣湖沼におけるインフルエンザウイルスの分布を調査する計画である。

著者

見上 彪 岡崎 克則 中島 員洋 松田 治男 平井 莞二 高橋 英司 東原 朋子

出版者

東京大学

雑誌

試験研究

巻号頁・発行日

1989

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現在,マレック病ウイルス(MDV)に起因する鶏のマレック病(MD)の予防には,主として七面鳥ヘルペスウイルス(HVT)の単価ワクチンが野外で広く用いられている。しかし現行のワクチンでは予防し得ない超強毒MDVによるMDが存在する。本研究はこのようなMDに対応し得るワクチン,組み換え体ワクチン,多価ワクチンあるいは成分ワクチンの開発を最終目的としている。以下結果を記載する。1。MDVのA抗原をコ-ドする遺伝子をBCに捜入し,リコンビナントウイルス(RCV)ーAを得た。これを接種した細胞の表面にはA抗原が発現していることが蛍光体法により確認された。 ^<35>S標識抗原とA抗原特異的単クロ-ン性抗体を用いて免疫沈降を行ったところ,感染細胞可溶化液中には多量の抗原が58ー68Kの位置に,また感染細胞上清には少量の抗原が46ー54Kの位置に認められた。発現A抗原はMDV感染血清と特異的に反応し,この抗原を接種した鶏の血清中にはMDV感染細胞と特異的に反応する抗体が検出された。2。MDV遺伝子中には単純ヘルペスウイルス(HSV)のgBに類似する糖蛋白をコ-ドする領域が存在する。この領域をBCに捜入して得たRCVーBは感染細胞の細胞質および細胞表面にMDV感染血清によつて認識される蛋白を発現した。この蛋白はMDVのB抗原に対する単クロ-ン性抗体や免疫血清とも反応した。またSDSーPAGEおよびMDV感染血清を用いたイムノブロット法により88/100,64および54Kdの分子量からなる蛋白であることが明らかとなった。3。胸腺切除および抗鶏CD4ないしCD8単クロ-ン性抗体投与によりCD4ないしCD8陽性T細胞を欠損させた鶏に強毒MDVを感染させた。CD8欠損鶏においては神経腫大とリンパ腫が認められたのに対して,CD4欠損鶏においては神経腫大のみが認められた。

著者

喜田 宏 河岡 義裕 岡崎 克則 伊藤 寿啓 小野 悦郎 清水 悠紀臣

出版者

北海道大学

雑誌

国際学術研究

巻号頁・発行日

1991

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我々は鳥類,動物および人のインフルエンザウイルスの生態を研究し,得られた成績に基づいて,1968年に人の間に出現した新型インフルエンザウイルスA/HongKong/68(H3N2)株のヘマグルチニン(HA)遺伝子の導入経路を推定し,提案した。すなわち,渡り鴨の間で継持されているH3インフルエンザウイルスが中国南部で家鴨に伝播し,さらにこれが豚に感染した。豚の呼吸器にはそれまでの人の流行株でうるアジア型(H2N2)ウイルスも同時に感染し,両ウイルスの間で遺伝子再集合が起こって,A/HongKong/68株が誕生したものと結論した。今後もこのような機序による新型ウイルスの出現が予想されるので,渡り鴨と豚のインフルエンザの疫学調査と感染実験を継続することによって,新型ウイルスを予測する研究を計画した。インフルエンザウイルスの供給源として,北方から飛来する渡り水禽および中国南部の家禽集団が考えられて来た。毎年,秋に飛来する渡り鴨からウイルスが高率に分離され,春に北方に帰る鴨からはほとんど運離されないことから,北方圏の鴨の営巣地が一次のウイルス遺伝子の貯蔵庫であると推定した。そこで,本学術調査では1991年および1992年の夏に,米国アラスカ州内の異なる地域で水禽の糞便を収集し,これからウイルスの分離を試みた。マガモとオナガガモ計1913,カナダガン1646,白鳥6,シギクおよびカモメ7合計2579の糞便材料から75株のインフルエンザウイルスおよび82株のパラミクンウイルスを分離した。インフルエンザウイルスはほとんどがアラスカ中央部ユコン平原の湖に営巣する鴨の糞便材料から分離されたが,南部のアンカレジ周辺や北部の材料からの分離率は極めて低かった。分離されたインフルエンザウイルスの抗原亜型はH3N8が14,H4N6が47,H8N2が1,H10N2が1,H10N7が11およびH10N9が1株であった。抗原亜型およびウイルスの分離率は,糞便材料を収集した鴨の営巣地点によって異なっていた。1992年には湖沼水からのウイルス分離をも試み,鴨の糞便から得られたものと同じH4N6ウイルスがそれぞれ2つの異なる湖の水から分離された。鴨の営巣地でその糞便から分離された14株のH3インフルエンザウイルスのHAの抗原性をモノクローナル抗体パネルを用いて詳細に解析した結果,A/HongKong/68ならびにアジアで鴨,家鴨および豚から分離されたH3ウイルスのHAと極く近縁であることが判明した。この成績は水禽の間で継持されているインフルエンザウイルスの抗原性が長年にわたって保存されているとの先の我々の見解を支持する。以上のように,鴨が夏にアラスカの営巣地でインフルエンザウイルスを高率に保有しており,湖水中にも活性ウイルスが存在することが明らかとなった。従って,北方の鴨の営巣地が一次のインフルエンザウイルス遺伝子の貯蔵庫であるとの推定が支持された。秋に鴨が渡りに飛び発つ前に,糞便と共に湖沼中に排泄されたウイルスは冬期間,凍結した湖水中に保存され,春に帰巣する鴨がこれを経口摂取して感染し増殖することを繰り返して存続して来たのであろう。秋,冬および春に一定の鴨の営巣地点で水,氷および凍土を検索することによって,自然界におけるウイルスの存続のメカニズムならびに遺伝子進化を知ることができるであろう。水禽の糞便から分離されたパラミクンウイルス82株のうち81株はニユーカッスル病ウイルス(NDV)であった。これらNDVのHNおよびF糖蛋白の抗原性をモノクローナル抗体パネルを用いて詳細に解析した結果,ワクチン株と異なるものが優勢であった。水禽の間に高率に分布しているNDVが家禽に導入される可能性が考えられるので,渡り鴨の糞便から分離されるNDVの抗原性ならびに鴨に対する病原性を継続して調査する必要があろう。

著者

喜田 宏 伊藤 壽啓 高田 礼人 岡崎 克則 河岡 義裕

出版者

北海道大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

1998

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シベリアの水禽営巣地ならびに北海道で採取した野鳥の糞便からインフルエンザウイルスを分離し、シベリアに営巣する水禽が様々なHA亜型のインフルエンザウイルスを保持していることを明らかにした。NPならびにH5HA遺伝子の系統進化解析の結果、1997年に香港のヒトとニワトリから分離された強毒H5N1インフルエンザウイルスの起源がこれらの水禽類にあることが判った。したがって、今後ヒトの間に侵入する新型ウイルスのHA亜型を予測するため、シベリア、アジアを含む広範な地域で鳥類インフルエンザの疫学調査を実施する必要がある。北海道のカモから分離した弱毒H5N4ウイルスを用いて強毒H5N1ウイルス感染に対するワクチンを試製し、これが有効であることを示した。そこで、疫学調査で分離されるウイルスは新型ウイルス出現に備え、ワクチン株として系統保存する計画を提案した(日米医学協力研究会2000、厚生省1999)。中国南部のブタにおける抗体調査の結果から、H5ウイルスの感染は少なくとも1977年から散発的に起こっていたことが判明した。一方、H9ウイルスは1983年以降に中国南部のブタに侵入し、その後ブタの間で流行を繰り返していることが判った。

著者

喜田 宏 伊藤 壽啓 梅村 孝司 藤田 正一 前出 吉光 中里 幸和 高田 礼人 岡崎 克則 板倉 智敏

出版者

北海道大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

1996

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ウイルスの病原性発現機構を宿主側の要因を詳細に解析することによって究明することを目的とした。そのため、ウイルス感染によって誘発される宿主細胞由来病原性因子の検出を試みた。インフルエンザウイルス感染発育鶏胚の奨尿膜を超音波破砕し、その可溶性画分をニワトリの静脈内に注射した。ニワトリは汎発性血管内凝固により数分以内に斃死した。この致死活性はヘパリンを静脈内に前投与することによって抑制されたことから、本因子は血液凝固に関与する物質と推定された。陰イオン交換体を用いた高速液体クロマトグラフィーおよび塩析法によって病原性細胞因子を濃縮精製する系を確立し、粗精製致死因子をマウスに免疫して、モノクローナル抗体11クローンを作出した。ニワトリの鼻腔内にインフルエンザウイルス強毒株と弱毒株を実験感染させ、経過を追及した。強毒株はウイルス血症を起こしたが、弱毒株はウイルス血症を起こさなかった。すなわち、強毒株を接種したニワトリでは全身臓器の血管内皮細胞でウイルス増殖が起こり、血管炎を招来した。強毒株の標的が血管内皮細胞であることが明らかになった。損傷した血管内皮細胞から血液凝固因子ならびにサイトカインが放出された結果、汎発性血管内血液凝固を起こし、ニワトリを死に至らしめるものと結論した。この成績はインフルエンザウイルス感染鶏胚奨尿膜から抽出した細胞因子がニワトリに血管内凝固を起す事実と一致する。汎発性血管内血液凝固症候群は様々なウイルス感染症で認められる。したがって、この細胞因子はインフルエンザのみならず他のウイルス感染症においても病原性発現に重要な役割を果たすものと考えられる。ウイルス感染症の治療法を確立するため、本致死因子をコードする遺伝子を同定する必要がある。

著者

喜田 宏 YAMNIKOVA Sv 河岡 義裕 高田 礼人 岡崎 克則 SVETRANA Yam デメネフ V. ヤムニコバ S. ルボフ D.K. 伊藤 壽啓

出版者

北海道大学

雑誌

国際学術研究

巻号頁・発行日

1995

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平成7〜9年夏、カムチャッカ半島南端付近、ハバロフスク郊外のアムール河流域ならびにサハ自治共和国内のレナ河流域において水禽の糞便および湖沼水3,000検体を採取した。8年にはレナ河流域北緯63度30分のコベイスキー地区で採取した約900検体の水禽糞便からインフルエンザウイルスH4N6亜型19株、H4N9亜型1株、H11N1亜型1株、H11N6亜型2株、H11N9亜型8株を分離した。9年にはコベイスキー地区で採取した水禽糞便120検体およびヤク-ツク(北緯62度)で採取した鴨の糞便72検体からは各々H4N6亜型1株およびH3N8亜型5株が分離された。一方、レナ河流域北緯65度00分〜64度36分の四十諸鳥地域で採取した水禽糞便約1,400検体と湖沼水20検体からはウイルスが分離されなかった。カムチャッカ半島ならびにアムール河流域で採取した水禽糞便からインフルエンザウイルスは分離されなかった。以上の成績は、鴨の営巣湖沼がレナ河流域北緯63度付近に存在することを示唆する。平成8年と9年の10月に北海道宗谷地方において採取した480検体の水禽糞便材料からインフルエンザウイルスH1N1亜型、H5N3亜型、H5N4亜型、H6N1亜型、H6N7亜型、H8N1亜型、H8N3亜型、H9N2亜型ならびにH11N9亜型各1株を分離した。平成8年度および9年度にレナ河流域および北海道の水禽糞便から分離したインフルエンザウイルスのNP遺伝子の系統進化解析を実施した。その結果、調べた分離株すべてが新型インフルエンザウイルスの発生地である中国南部を含むアジア大陸に分布するウイルスの系統に属することが判明した。以上の成績は、新型インフルエンザウイルスの抗原亜型を予測するために、シベリアの水禽営巣地におけるインフルエンザウイルスの分布をさらに解明する必要があることを示している。

著者

喜田 宏 岡崎 克則 迫田 義博 河岡 義裕 高田 礼人 伊藤 壽啓

出版者

北海道大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

2000

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新型ウイルスの亜型予測に資するため、鳥類および動物インフルエンザウイルスの疫学調査を実施した。ロシア、モンゴル、中国および北海道で、渡りカモの糞便3,987検体を採取し、亜型の異なるインフルエンザAウイルス212株を分離した。宮城県のブタからH1N2ウイルスを分離した。北海道大学を含む動物インフルエンザセンター5機関で25株のH9ウイルス株を交換し、解析を共同で開始した。渡りカモのウイルス遺伝子を比較解析したところ、日本で分離されたH9インフルエンザウイルスと1996年に韓国でニワトリに被害をもたらしたウイルスが近縁であった。1995~1999年に中国のニワトリから分離されたH9N2ウイルスの遺伝子解析の結果、渡りカモのウイルスと異なる亜群に分類され、ノイラミニダーゼに欠損が認められた。内部蛋白遺伝子は1997年の香港の強毒H5N1ウイルスに内部蛋白遺伝子を供給したH9N2ウイルスの系統とは異なった。香港のブタ、カスピ海のアザラシの抗体調査を行い、インフルエンザウイルスが感染した成績を得た。インフルエンザウイルスの異種動物間伝播機構を明らかにするため、ニワトリ雛の気嚢継代によって得たニワトリ馴化株の遺伝子再集合体を作出し、ニワトリ肺における増殖性を調べた。HA遺伝子を入れ替えた遺伝子再集合体の増殖性に変化はなく、他の因子が関与することが示唆された。新型ウイルスの出現に備え世界の動物インフルエンザの疫学調査とワクチン候補株を系統保存・管理するプロジェクトをWHOに提案し、各国とのネットワーク形成に支援が得られることになった。

著者

岡崎 克則 井上 恵美

出版者

北海道医療大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

2006

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インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)のC末端側サブユニット(HA2)に存在するαヘリックス領域のアミノ酸配列がH1〜H15亜型ウイルス間でよく保存されていることを見出し、本領域に含まれる10残基のペプチドを培地中に添加するとウイルス増殖が1/10程度に抑制されることを示した。感染細胞内で新たに合成されたHAの三量体形成を阻害することによってHAの輸送あるいは機能的発現を阻害するものと考えられたことから、エンドサイトーシス非依存性のトランスフェクション試薬を用いて本ペプチドを積極的に細胞内に導入することによって抗ウイルス活性を増強することを試みた。その結果、ウイルス感染前および後におけるペプチド導入でもウイルス増殖抑制効果は認められなかった。三量体形成に与る粗面小胞体〜ゴルジ体への導入には、エンドソームを経由する経路が有効なのかもしれない。新型インフルエンザに備えた抗体医薬を開発するため、H5およびH2亜型HAに対するモノクローナル抗体の作製を試みた。両亜型HA間で共通かつ分子表面に存在する7残基のアミノ酸配列を見出し、これをマウスI-A^b MHCクラスII分子結合カセットに挿入したペプチドを合成した。本ペプチドをC57BL/6マウスに免疫し、SP2/0細胞を用いてハイブリドーマを作出した。得られた800余りのハイブリドーマのうち1クローンがA/Singapore/1/57(H2N2)の感染性を中和する抗体を産生していた。現在、効率を上げるためにMAPペプチドを免疫したマウスの脾細胞を用いてハイブリドーマを作出している。

著者

喜田 宏 梅村 孝司 迫田 義博 伊藤 壽啓 小笠原 一誠 河岡 義裕 岡崎 克則

出版者

北海道大学

雑誌

基盤研究(S)

巻号頁・発行日

2003

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本研究は、家禽と家畜のインフルエンザの被害を未然に防ぐとともに、ヒトの新型インフルエンザウイルスの出現に備え、その予防と制圧に資することを目的とする。・動物インフルエンザのグローバルサーベイランスによるウイルス分布の解明2006年秋、日本、モンゴルにおいて採取された渡りガモおよびハクチョウの糞便材料からのウイルス分離を試みた。1,201検体の材料から合計55株のインフルエンザAウイルスを分離同定した。これらの分離株にはH5やH7亜型のインフルエンザウイルスは含まれていなかった。これまでのウイルス分離の成績と合わせると、H1-H16およびN1-N9までの144通りの組合せのうち、133通りのウイルスの系統保存を完了した。・インフルエンザウイルスの病原性決定因子の同定2006年夏、モンゴルの湖沼で死亡野烏が再び発見され、死亡したオオハクチョウおよびホオジロガモの臓器材料からH5N1亜型の高病原性鳥インフルエンザウイルスが分離された。分離されたウイルスは、2005年中国やモンゴルの野生水禽から分離された高病原性のH5N1ウイルスと8つの遺伝子分節すべてが近縁であった。また、このウイルスに対して哺乳動物が高い感受性を示すことが動物試験から明らかにした。・ベッドサイド早期迅速インフルエンザ診断法の開発A型インフルエンザウイルスH5およびH7亜型抗原を特異的に検出する簡易診断キットを開発した。本キットの有用性を実験感染動物の材料を用いて評価したところ、NP検出キットより感度は劣るが、H5およびH7抗原を特異的に検出でき、ベットサイド診断法として有用であることが確認された。