11 0 0 0 OA CD69-Myl9システムによる新規炎症制御機構の解明
アレルギー性気道炎症は炎症細胞が肺組織に集積することで引き起こされる。我々はこれまでに、T細胞の発現するCD69がそのリガンドであるミオシン軽鎖9/12との会合を介し、組織移行を促すことで気道炎症を誘導する事を報告し、この新規気道炎症制御機構をCD69-Myl9システムと命名した。本システムは気道炎症のみならず様々な疾患にも関与することが推測されるが、その詳細は不明であった。本研究により、CD69-Myl9システムの分子機構の一端を、そして病態形成への関与を明らかにすることができた。今後、より詳細に解析を進めることで、CD69-Myl9システムの治療ターゲットとしての可能性を明らかにしたい。
我々の2016年の報告では、ヒトの風邪の病原体、ヒトコロナウイルスHCoV-229Eは、患者検体から分離された直後は、細胞表面のプロテアーゼ(TMPRSS2)を利用して細胞表面から侵入するが、培養細胞で継代することにより、エンドソーム経路を通りエンドソームのプロテアーゼ(カテプシンL)を利用するように変異することを示した。さらにこの変異ウイルスは、分化したヒト呼吸器上皮細胞(HBTE細胞)では感染力が著しく弱くなることを示した。これらの結果は、HCoV-229Eは生体内ではエンドソーム経路を避けていることを示唆している。本研究においてこれまでに、HCoV-229Eに加え他のヒトコロナウイルス、HCoV-OC43、HCoV-HKU1も臨床分離ウイルスは細胞表面のTMPRSS2を利用して積極的に侵入することを論文報告した。これで我々の仮説である「生体内ではヒトコロナウイルスはエンドソーム経路を避ける」が正しいことが三種のウイルスで確認されたことになる。一方、米国のグループは、中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)がゴルジ体のプロテアーゼFurinを利用して細胞侵入することを報告している。この報告について我々は否定的な見解をもっており、我々の研究を進めるうえで、どうしてもFurin経路を否定しておく必要に迫られることとなった。すこし回り道をすることとなったが、MERS-CoV及び他のコロナウイルスはFurinを使って細胞侵入しないことの証明に成功し、論文報告をおこなった。現在我々は、「ウイルスの細胞侵入経路が自然免疫誘導に及ぼす影響」を調べるために、準備を行っている。また解析で得られた知見をもとに、抗ウイルス薬の作用機序の解析も行っている。
4 0 0 0 OA ゲノム編集による改良型ウイルス感染宿主細胞の構築
感染症対策に汎用されるVero細胞には複数の亜株が存在する。ゲノム比較解析から、同細胞亜株は二系統に大別できるが、内在性レトロウイルス挿入位置やI型インターフェロン遺伝子クラスターのホモ接合性欠失位置は亜株間で同一であることを明らかにした。黄熱ウイルス17Dレプリコンが持続複製するVero細胞を作製した他、WHOが主導するポリオ根絶計画に寄与すべく、ポリオウイルス増殖能のないVero細胞も作製した。ヒト肝がん由来 HuH-7細胞系統の亜株でC型肝炎ウイルス産生能が高いHuh7.5.1-8細胞についてウイルス学的な有用性を見出し、HuH-7細胞系統におけるRIG-I変異の実態も明らかにした。
4 0 0 0 OA SARS-CoVに対する不活化ワクチンの副反応機序の解明とその改善について
重症急性呼吸器症候群 (SARS) コロナウイルス(SARS-CoV)は重症呼吸器疾患を引き起こす新興ウイルスである。ワクチンや治療薬はまだ開発されていない。UV不活化SARS-CoV全粒子(UV-V)は多くのエピトープやタンパクを含んでおり、SARSのワクチン候補とされている。しかしながら、ヌクレオカプシドタンパクを含む不活化SARSワクチンはウイルス感染後マウスの肺に好酸球浸潤を示すことが報告されている。今回、Toll-like receptor (TLR) アゴニストがUV-Vワクチンの副反応を軽減するか半年齢のBALB/cマウスで調べた。UV-V、水酸化アルミニウム(Alum)添加UV-Vで免疫した半年齢マウスは、マウス馴化SARS-CoVの感染に対して一部防御を示し、組織学的に肺で肺胞傷害像は見られなかったが、血管周囲に広汎な好酸球浸潤が見られた。一方、リポポリサッカライド、Poly(I:C)、PolyUを含むTLRアゴニストを添加したUV-V(UV-V+TLR)で免疫したマウスでは、肺での好酸球浸潤が著しく減少した。そして肺のサイトカイン量の測定で好酸球誘導に関わるIL-4およびIL-13の値がUV-V免疫マウスよりも低いことが示された。加えて、マイクロアレイ解析でUV-V免疫マウスでは好酸球誘導に関わる遺伝子の発現が高くなっていたのに対し、UV-V+TLR免疫マウスではそれらは低く、むしろTLR3および4の下流に位置する遺伝子の発現が高くなっていることが分かった。これらの結果から、SARS-CoV感染により引き起こされる肺のワクチン誘発性好酸球浸潤はTLRアゴニストをアジュバントにすることにより、回避できると示唆された。
4 0 0 0 OA 川崎病患児・急性期便から分離された新規レンサ球菌のゲノム解読と病原性解析
川崎病患者28人について、入院時・半年後(充分な回復期)の2ポイントで便を採取し、次世代シークエンサーによるメタゲノム解析の結果、入院急性期ではStreptococcus 属に顕著な検出率を認め、回復後の遠隔期では Ruminococcus属の増加が顕著であった。 (Front Microbiol. 2015 Aug 11;6:824.) 川崎病を4回再燃発症した患児の便からも同様に Streptococcus spp. が有意に検出され、上記成果と関連した結果が示唆された。(JMM Case Rep. 2016 Feb 1;3(1):e005019.)
2 0 0 0 SARS-coronavirusワクチン開発に関する基礎研究
目的:本研究では、SARS-CoVに対する有効なワクチン開発のための基礎的研究を行うことを目的とする。成果:ヒトに即時に応用することが可能なワクチンとして、マウスモデルにおいてUV照射不活化ウイルス粒子ワクチンを皮下に2回接種し、これにより誘導される免疫応答を解析した。その結果、中和活性のあるIgG抗体がUV照射不活化ウイルス粒子のみで誘導可能であり、しかも長期に存続すること、アラムアジュバントを使うことにより抗体価は更に10倍以上高まることを明らかにした。安全性を更に高めるためにUV照射にホルマリン処理を加え、UV照射のみの不活化ウイルス粒子により誘導される免疫応答との比較を行った。ホルマリン処理したUV照射不活化ウイルス粒子免疫群と未処理のUV照射不活化ウイルス粒子免疫群とで血中のSARS-CoVに対するIgG抗体価を比較すると、ホルマリン処理をすることにより血中抗体価が多少低下する傾向はあるものの、中和活性のある抗体の誘導は十分可能であった。これらのマウス骨髄中のSARS-CoVのNucleocapsidに対する抗体産生細胞数は両群ともに増加しており、その数に有意差は認められなかった。また、ワクチン接種部位の所属リンパ節(腋下)のT細胞はウイルス粒子抗原に反応していくつかのTh1/Th2タイプのサイトカインを産生するが、ホルマリン処理群では非処理群と比較してIFN-の産生量がやや高く、IL-5産生量はむしろ低い傾向にあった。一方、投与部位に関しては、石井孝司博士(感染研ウイルス2部)が開発したSARS抗原を発現する弱毒ワクシニアウイルス(DIs)ワクチンを用いて皮下接種と経鼻接種における感染防御効果を比較した。経鼻免疫で誘導される鼻腔粘膜IgA抗体は皮下免疫ではほとんど誘導されないにもかかわらず、高濃度の血中IgG抗体に依存してSARS-CoVの呼吸器感染に対する防御効果が認められた。従ってUVとホルマリンで不活化したウイルス粒子によるワクチンは、即座にヒトに応用可能な安全性の高いSARSワクチンとしてのみならず、今後の新興感染症への緊急対策として有効であることが示された。
2 0 0 0 OA 南米チリにおける裂頭条虫の分子疫学、生活史とヒトへの感染経路に関する調査研究
南米チリは世界有数の養殖サケ・マスの生産国であり、わが国はそのサケ・マスの主要な消費国である。チリに分布するサケ・マスにはヒトに寄生する裂頭条虫の感染が知られており、これらのサケ・マスを感染源とする裂頭条虫症の発生が懸念されている。本研究では、チリ南部のプエルト・モンのジャンキウエ湖、ならびにパンギプジ湖に生息するサケ属や在来魚における裂頭条虫幼虫の寄生状況等を調査した。その結果、ギンザケやニジマスに多数の裂頭条虫幼虫の感染が確認され、筋肉内からも幼虫が検出されたことから、チリでは広節裂頭条虫による感染源がサケ類と推定された。
2 0 0 0 腸管出血性大腸菌に対するワクチンの開発研究
腸管出血性大腸菌は、ヒトだけではなく家畜からも多数分離されており、ウシやブタの腸管出血性大腸菌感染症は畜産業界では大きな問題となっている。本感染症の感染源は、主として食肉で感染した家畜の糞便中の腸管出血性大腸菌が何らかの経路でヒトへ感染すると考えられている。従って、家畜の腸管出血性大腸菌感染を予防できるワクチンの開発は畜産業界に有用であるばかりでなく、ヒトの腸管出血性大腸菌感染、それに引き続く出血性大腸炎や溶血性尿毒症症候群の予防にも有効である。本研究では、ブタの浮腫病の原因である腸管出血性大腸菌に対するワクチン株を構築し、その有効性を証明した。すなわち、浮腫病のブタから分離したベロ毒素(VT2eまたはVT2vp1)を産生する腸管出血性大腸菌について、抗原性は保有するが毒素活性の喪失した変異毒素を産生する変異株を作出した。まず、VT2vp1のAサブユニットN末端から167番目のグルタミン酸(E167)と170番目のアルギニン(R170)を、それぞれグルタミン(Q167)とロイシン(L170)に置換したVT2vp1変異毒素を産生するような遺伝子を作出した。この遺伝子と野生型の毒素遺伝子を相同組換えにより置き換え、変異株を作出した。この変異株は野生型の毒素と同様の抗原性は保持していたが、ベロ細胞を用いた試験により毒素活性が喪夫していた。また、この変異株の豚への毒力を野生株を対照にして調べた結果、病原性は喪失していた。この変異株をワクチン候補株として、感染防御能を調べたところ、変異株を投与した豚群(n=20)は浮腫病由来の野生株の投与に対して浮腫病の発症はみられなかったが、ワクチン株を投与しなかった豚群(n=20)では、12頭が浮腫病を発症し、死亡した。また、変異株投与豚において、血中IgG価および糞便中IgA価の上昇も確認された。
2 0 0 0 OA 擬似粒子を用いたポリオ後症候群モデルマウスの作製
ポリオウイルス(PV)擬似粒子を用いてPVレセプター発現マウス(TgPVR21マウス)に残存性ポリオ様麻痺を生じさせる条件を確立し、残存性ポリオ様麻痺を長期間生じさせたマウスについて解析した。また、ポリオ後症候群の発症に関与する宿主遺伝子群を同定することを目的とし、PVの複製を阻害する化合物の探索を行った。結果、4.1×10^6感染単位以上のポリオウイルス擬似粒子を脊髄内に接種した場合、ほぼ全てのマウスが重篤な残存性ポリオ様麻痺を呈した。このマウスを運動負荷の有無で6ヶ月間飼育したが、誘導されたポリオ様麻痺と運動負荷を原因とする異常を確認することができなかった。PV複製を阻害する化合物として、GW5074(Raf-1阻害剤)を同定し、GW5074と協調的に働くキナーゼ阻害剤としてMEK1/2阻害剤、EGFR阻害剤、PI3K阻害剤を同定した。GW5074に対する耐性変異を同定し、阻害機構が不明である既知の抗ピコルナウイルス化合物enviroximeに対する耐性変異と同じ変異であることを見出した。さらに、GW5074が宿主のphosphatidylinositol 4-kinase III beta (PI4KB)の活性を阻害することによりPVの複製を阻害することを見出し、PI4KBがenviroxime様化合物のエンテロウイルス複製阻害活性の標的の一つであることを明らかにした。
2 0 0 0 OA HIV-1Nefによるマクロファージの自然免疫機能攪乱とエイズ病態形成の機構
1 0 0 0 SARSコロナウイルス細胞侵入の分子機構に関する研究
SARS-CoVは、受容体ACE2に結合後、エンドゾームに輸送され、cathepsin-Lなどのプロテアーゼによりスパイク(S)蛋白の膜融合能が活性化され、細胞侵入するという、エンドゾーム経路で細胞内へ侵入する。一方、我々は外来性のプロテアーゼが存在する場合、細胞表面から侵入する可能性を提唱した。この細胞表面からの侵入は、ACE2結合したS蛋白がプロテアーゼにより解裂され、膜融合活性を獲得するために可能になると考えられている。本研究では、この仮説を検証するため、解裂性S蛋白を持つpseudotypeウイルスを用いて、細胞表面からの侵入が可能か否かに付いて検討した。SARS-CoV S蛋白上の細胞内プロテアーゼ(フリン)により解裂が予想される3か所にプロテアーゼ認識アミノ酸配列を導入した変異S蛋白を作成した。このS蛋白をenvelope上に持つ水泡生口内炎ウイルス(VSV)のpseudotypeウイルスを作成し、その細胞侵入経路を検討した。3か所の変異挿入部位の中で、S蛋白797/798で解裂が起こるよう設計されたS蛋白は、細胞融合性を示し、pseudotype envelope上に発現された。このpseudotypeは、SARS-CoV非解裂性S蛋白を持つpseudotypeと比べ、エンドゾーム経由感染阻止薬による感染抑制はなく、また、SARS-CoVがエンドゾーム内で活性化されるプロテアーゼ阻害剤の影響も低かった。以上の結果から、解裂性S蛋白を持つpseudotypeは細胞表面から侵入することが強く示唆された。即ち、SARS-CoVはプロテアーゼの存在下で直接細胞膜から細胞侵入する能力を有することが確認された。マウス肝炎ウイルス(MHV)のS蛋白のheptad repeat由来peptideは膜融合活性を阻害することでウイルス感染を阻止することが報告されている。SARS-CoVのS蛋白でも同様の実験がなされたが、MHVに比べて阻害効率が著しく悪い事が報告されている。我々は、外来性のプロテアーゼ存在下、細胞表面からの感染が可能な状態で、peptideの感染阻害効率を再評価した。この結果、細胞表面からのウイルス感染では従来考えられていたよりも低濃度のpeptideで効率よく阻害できる事が分かった。このことは、これらのpeptideが潜在的なSARS-CoVに対するinhibitorとなりえる事を示唆するもので、SARS-CoVの感染経路にpeptideをターゲティングする事でSARS-CoVの感染を効率よく阻止できる可能性を示した。
1 0 0 0 OA 少量ゲノム含有検体に解析対象を広げた梅毒トレポネーマゲノム多様性の体系的再評価
2017年、2018年の国内梅毒トレポネーマ検体につき、分子型別、マクロライド耐性分布に関して検討を実施しMSM由来とheterosexuals由来とで大きな差異が有ることが判明し、報告した。2014~ 2018年の検体につき全ゲノム解析を試行し、計20検体で成功した。世界各国検体でのデータと比較解析を行い、日本株は中国株と最近縁の関係にあることを示すと同時にこの2国の株をほぼ細分化できる一塩基置換候補を抽出することに成功した。型別、マクロライド耐性分布で差異の見られた国内のMSM由来とheterosexuals由来株の差はこの全ゲノム解析によっても裏付けられた。
1 0 0 0 OA 感染症発生動向の可視化及び疫学的解析システムの開発
感染症発生動向調査(NESID)の全数把握対象疾患(87疾患)の届出データの可視化・分析システムの設計、開発、及び改良を行った。本可視化システムは、リアルタイムな感染症発生(報告)状況把握と異常検知、週報集計時点の報告数と今後の動向予測、過去の発生動向データとその関連情報が参照できる感染症情報ライブラリの機能を備えたシステムとして開発を進めた。具体的には、時・人・場所の観点からデータを容易に把握できるように工夫し、過去の平均的な増加率に基づく年間累積報告数の見積値を確認できるようにするとともに、感染症発生動向調査やその周辺制度に関連する様々な情報を紐づけて表示する機能を実装した。
1 0 0 0 OA トキソプラズマ原虫における植物ホルモン生合成能の存在意義の解明
我々はアピコンプレクス門原虫がいくつかの植物ホルモンを産生し、増殖の制御に用いている可能性を見出した。本研究ではそれらうち、サイトカイニンがトキソプラズマに与える影響についてさらに詳細に検討した。サイトカイニンには植物が自然界で生合成しているものと人工合成されたものに大別でき、いずれも細胞分裂の促進、光合成の活性化、葉緑体の分化・増殖といった作用を持つ。そこでそれぞれのサイトカイニンをトキソプラズマの培養中に添加し、原虫の増殖率を測定したところ、天然サイトカイニン(trans-zeatin)は、高等植物の知見から期待されるとおり原虫の増殖が促進したが、合成サイトカイニン(thidiazuron)は逆に原虫の増殖を阻害した。この増殖調節は高等植物での知見と同様、ある特定のサイクリンの発現量に依存していた。また通常原虫内に1つしか観察されないアピコプラストの数が、trans-zeatin処理により劇的に上昇し、逆にthidiazuron処理により消失した。更にELISAによる結果から、原虫はサイトカイニンを産生しているものと思われた。以上の結果からトキソプラズマにおいて植物ホルモンであるサイトカイニンは、ある特定のサイクリンの発現を制御することで、原虫の細胞周期自体と、細胞周期の進行と厳密にリンクしているアピコプラストの分裂のタイミングを調節しているものと考えられた。
1 0 0 0 1型ヒト免疫不全ウイルスのVpr蛋白質の構造と機能に関する研究
HIVのインテグラーゼに対するマウスモノクローナル抗体を作製し、このマウスモノクローナル抗体から単鎖抗インテグラーゼ抗体分子(scAbE)を作製した。scAbEとHIVのアクセサリータンパク質であるVprとの融合タンパク質(scAbE-Vpr)、およびVprと結合することが明らかになっているペプチドモチーフ(WxxF)を付加したscAbE分子(scAbE-WxxF)を作製した。さらにscAbEとHIVのキャプシッドタンパク質(CA)との融合タンパク質(scAbE-CA)も作製した。これらタンパク質を発現するヘクターDNAをHIV infectious clone DNA(pLAI)とともにヒト細胞293Tにtransfectして培養上清中のウイルスを回収した。ウイルス粒子のタンパク質について、ウェスタンブロット法で調べたところscAbE-VprとscAbE-WXXFは効率よくウイルス粒子内に取り込まれていた。しかし、scAbEあるいはscAbE-CAはウイルス粒子には取り込まれなかった。これらウイルスの感染性をMAGIアッセイ法にて調べた。同じ量のRT活性で比較した場合、野生型ウイルスに比べてscAbE-Vprを取り込んだウイルスとscAbE-WxxFを取り込んだウイルスとでは、感染性が最大で、それぞれ10^3倍、10^4倍低下した。scAbE-WxxFを安定に発現するHeLa細胞を樹立できたが、その一方で、scAbE-Vprを安定に発現するHeLa細胞は得られなかった。このようにウイルス粒子に取り込まれてそのウイルス粒子の感染性を低下せしめる分子は全く新規の抗ウイルス治療分子であるので、packageable ativiral therapeutics(PAT)と命名した。scAbE-Vprとは異なりscAbE-WxxFは細胞毒性を呈さず、より理想的なPAT分子と思われた。この分子はAIDSの遺伝子治療に応用できるだろう。
1 0 0 0 OA バクテリオファージが引き起こす腸内細菌叢破綻メカニズムに関する研究
腸管内バクテリオファージを効率的且つ簡便に回収する方法を考案し、新規バクテリオファージのゲノム配列を確定した。抗菌薬多剤併用療法を実施した潰瘍性大腸炎患者の治療前後の腸内細菌叢解析をメタゲノム解析により行い、抗菌薬多剤併用療法開始前の活動期に多く存在する細菌種、及び、治療後の寛解期で多く存在する細菌種が確認された。更に、phageome解析を行ったが、各患者で多様なパターンを示し、治療前後での共通性は認められなかった。しかし、個人の治療前後でのファージ組成は大きく変化していた。回収したファージを用いた細菌叢への感染実験を行ったが、供与したファージの増加は認められなかった
1 0 0 0 OA クラリスロマイシン耐性肺MAC症に対する新たな治療薬の開発
クラリスロマイシン耐性肺MAC症に有効な薬剤の開発のため、肺MAC症患者由来クラリスロマイシン高度耐性のMAC株を用いて37種のアベルメクチン誘導体の効果を測定した結果、MAC41株全てに対して抗菌活性を示す誘導体5種を見出した。これら5種は、既存のマクロライドのターゲット部位である50SリボソームのDomeinⅤ2057-2059 部位ではなく、未知の分子を標的部位としていることが示唆された。これら5種の誘導体は細胞内のMACに対しても抗菌効果を発揮し、抗菌活性は既存のイベルメクチンよりも高いことが明らかとなった。
1 0 0 0 Keterah orthonairovirusの学術推進
1 0 0 0 OA ヒトパピローマウイルス感染初期過程における宿主蛋白質の役割
ヒトパピローマウイルス(HPV)はエンヴェロープの無い小型DNAウイルスである。キャプシドはL1とL2から構成される。本研究ではHPV感染の初期過程に重要な役割を果たすL2と特異的に相互作用する宿主蛋白質を同定し、この相互作用に依存したHPV感染の分子機構の解明を試みた。L2に特異的に相互作用する細胞内蛋白質Transport protein particle complex subunit 8 (TRAPPC8)を同定した。このTRAPPC8はHPVの細胞内侵入に必須な蛋白質であることが分かった。ただし、この侵入機構にL2-TRAPPC8相互作用は無関係であった。一方、L2はゴルジ体を特異的に分散することが明らかとなり、この分散はTRAPPC8ノックダウン細胞のそれと酷似していた。HPVはL1キャプシドを介したTRAPPC8に依存したエンドサイトーシス機構を利用して細胞内に侵入した後、L2がTRAPPC8の機能を阻害し、感染を成功させると推察された。このL2によるTRAPPC8の機能阻害はウイルスゲノムがトランスゴルジネットワーク(TGN)から脱出する機構に重要な役割を果たすと考えられた。