著者

富永 敬一郎

出版者

Japanese Society of Animal Reproduction

雑誌

The Journal of reproduction and development (ISSN:09168818)

巻号頁・発行日

vol.50, no.1, pp.29-38, 2004-02-01

参考文献数

56

被引用文献数

3 20

---

胚に対するグリセリンの浸透圧ショックを緩和するために希釈時に用いられるスクロースの細胞毒性を緩和することを目的として、ストロー内でスクロースによるグリセリン希釈を行った後、さらに、胚に影響しない濃度まで培養液で希釈するストロー内2段階希釈直接移植法を開発した。野外での体内回収胚移植で、この方法はエチレングリコールを用いたダイレクト法と同等の受胎率であった。16細胞期胚の緩慢凍結法において、最適耐凍剤を選定するとともに、リノール酸アルブミンの培養液への添加や、遠心処理で細胞内脂肪を局在化させることによる胚細胞外への除去を試みた。その結果、エチレングリコール区がプロパンディオール区やDMSO区より胚盤胞への発生率が高く、LAA添加は無添加に比べて凍結融解後の胚盤胞への発生率を向上させた。また、2細胞期で遠心処理した16細胞期胚では脂肪大部分除去区の凍結融解後の胚盤胞への発生率は無遠心凍結区より高く、無遠心新鮮区の胚盤胞の細胞数と差はみられなかった。次に、体外受精後2細胞期から胚盤胞期までの胚について、ゲル・ローディング・チップ(GL-ip)を用いた超急速ガラス化法を検討した結果、すべての発育日齢で50%を越える高い胚盤胞への発生率が得られ、発生率及び胚盤胞の細胞数、細胞構成において、それぞれの日齢の新鮮胚対照区と差はみられなかった。また、体外受精7日目胚盤胞のGL-ipガラス化法は緩慢凍結法より生存率が高かった。体内回収胚の発生速度の速い胚盤胞や形態の良好な高品質胚に雄が多いが、この関係は交配種雄牛毎に異なることを明らかにした。また、個体毎に区別した体外受精由来胚では、胚の発生速度あるいは胚盤胞生産率と性別とに関係がみられないことや、切断2分離胚後、雄胚が高品質胚へ早く形態回復することを明らかにした。性判別した体内回収胚にGL‐ipガラス化法を応用した結果、対照の新鮮胚移植と変わらない受胎率が得られた。体外受精由来3、4日目胚から1-2割球をサンプリングし、サンプルをPEP‐PCR、DNA産物を精製し、性判別PCRに供した。同時に、サンプリング胚を7日目まで培養し、発生した胚盤胞をGL-ipガラス化した。その結果、性別が高率に判定でき、ガラス化した胚盤胞は新鮮胚と変わらない高い生存率が得られ、しかも、ガラス化胚が子牛への発生能を持つことを明らかにした。