【背景と目的】 近年、筆者らはC型肝炎ウイルスのゲノム複製に寄与する新規のRNAヘリカーゼ遺伝子として、YTH domain containing 2 (YTHDC2)を同定した。ヒトの正常組織および様々な癌細胞株を用いてYTHDC2遺伝子の発現を調べた結果、正常組織では発現が低いが、一方で多くの癌細胞株では発現が高いことが明らかになった[参考論文(B), 3 ; Morohashi, Tanabe (9th author) et al., PLoS one, 6, e18285, 2011]。また、これまでの研究で、様々なRNAヘリカーゼが癌遺伝子の翻訳を促進することで癌細胞の悪性化に寄与していることが報告されている。そこで本研究では、癌化に伴って発現が亢進するYTHDC2の転写制御機構および癌細胞の主要な悪性形質の一つである癌転移におけるYTHDC2の役割について解析した。第1章:YTHDC2の転写制御機構解析 はじめに、YTHDC2の転写開始に重要なプロモーター領域を同定するために、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。ヒト肝癌細胞株Huh-7を用いて実験した結果、転写開始点より−261から+159塩基の領域が重要であることが示唆された。データベースによる解析により、その領域内にはcAMP Response Element(CRE)、GATA、AP-1の3種類の転写因子結合サイトが含まれていることがわかった。そこで、それぞれの結合サイトに変異を導入して、再度ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った結果、CREサイトに変異を導入したときのみプロモーターの活性が低下したため、このCREサイトがYTHDC2遺伝子の転写に重要であることが示唆された。次にこのCREサイトに結合する転写因子を同定するためにクロマチン免疫沈降法(ChIP)を行った。Huh-7細胞を用いて実験した結果、このCREサイトには転写因子c-Jun, ATF2が結合することが明らかになった。また、これらの転写因子は炎症性サイトカインTNFαで刺激したヒト正常肝細胞でも活性化し、YTHDC2の転写に寄与していることが示唆された(参考論文(A), 1; Tanabe et al., Gene, 535, 24-32, 2014)。第2章:YTHDC2の転移促進効果についての解析 YTHDC2における癌化形質、特に癌細胞転移への役割を調べるために、ヒト大腸癌細胞株HCT116においてRNA干渉法によるYTHDC2遺伝子発現が持続的抑制された細胞株の作出を試みた。まずは既知のヒト遺伝子を標的としていないshRNA (non-target shRNA)とYTHDC2を標的とするshRNA (YTHDC2-shRNA)をそれぞれ形質導入した。その結果、YTHDC2のmRNA発現量が野生型のHCT116細胞とほとんど変わらないコントロールHCT116細胞株(sh-cont細胞)とYTHDC2のmRNA発現量が野生型のHCT116細胞に比べて約80%低下したYTHDC2ノックダウン細胞株(Y2-KD細胞)を樹立した。樹立した細胞株の運動能力をWound HealingアッセイとTranswellアッセイによって解析した。Wound Healingアッセイは、高密度で培養されている細胞が人工的に作った新しいスペース(Wound)に移動する量を調べることで二次元的な細胞運動能力を測定する方法である。Transwellアッセイは、細胞がTranswellのメンブレンに開いている8μmの穴を通り抜けて反対側に移動した量を調べることで三次元的な運動能力を測定する方法である。in vitroにおける2種類の運動能力測定法により、Y2-KD細胞の運動能力がsh-cont細胞に比べて大きく低下していることがわかった。また、Y2-KD細胞にYTHDC2遺伝子を再発現させることで細胞の運動能力が回復するか否かをTranswellアッセイによって解析した。その結果、YTHDC2遺伝子を再発現させたY2-KD細胞の運動能力は、sh-cont細胞と同程度まで回復した。 さらに、in vivoにおけるY2-KD細胞の転移能力を調べるために、ヌードマウスの脾臓にY2-KD細胞を移植し、肝臓に転移するか否かを調べた。その結果、sh-cont細胞の移植を移植したマウスでは全例で肝臓への転移が見られたが、Y2-KD細胞を移植したマウスでは、5例中2例だけにしか肝臓への転移が見られなかった。以上の結果から、YTHDC2は大腸癌細胞の転移に寄与していることが示唆された。 サイクロスポリンA(CsA)にはYTHDC2の分子機能を阻害する効果が認められている[参考論文(B), 3 ; Morohashi, Tanabe (9th author) et al., PLoS one, 6, e18285, 2011]。そこで、先の野生型HCT116細胞を移植した肝転移モデルマウスにCsAを投与すると、やはり転移が抑制された。以上の結果からCsAがYTHDC2の分子機能を阻害し、大腸癌細胞の転移を抑制したことが示唆された。 次に、YTHDC2の作用が実際にヒト大腸癌の進行度に関連しているのか否かを外科病理学的に調べた。ヒト大腸癌患者由来の72例の病理組織標本(札幌医科大学医学部・消化器外科講座との共同研究)を当研究室で作製した抗YTHDC2モノクローナル抗体を用い、免疫組織化学染色を行った。その結果、YTHDC2の発現レベルと癌の進行度(Stage)およびリンパ節転移の間に有意な正の相関が認められ、臨床的にもYTHDC2が転移を伴う大腸癌の進行に重要な役割を持つことが示唆された。(参考論文(A), 2; Tanabe et al., Cancer Letters, in press)第3章:YTHDC2によるHIF-1αの翻訳促進機構の解析 固形癌における癌細胞転移では、固形癌内部の低酸素環境が引き金となって、上皮間葉系転換が誘導されて癌細胞が転移能力を獲得することが知られている。そこで筆者は、低酸素環境下において重要な役割を果たしている低酸素誘導因子1α (Hypoxia Inducible Factor-1α:HIF-1α)とYTHDC2との相互作用について解析した。HIF-1αは正常酸素環境では、ユビキチン-プロテアソーム経路を介してタンパク質分解されるため、タンパク質の発現量が減少しているが、低酸素環境では、ユビキチン化が阻害されるのでタンパク質の発現量が増加する。そこでまず始めにsh-cont細胞とY2-KD細胞を酸素濃度1%の低酸素環境で培養し、HIF-1αの発現量を調べた。その結果、低酸素環境におけるHIF-1αのmRNA発現量にはsh-cont細胞とY2-KD細胞の間で有意な差がなかった。しかしながら、HIF-1αタンパク質発現量はsh-cont細胞では大きく増加しているが、Y2-KD細胞では増加していなかった。これらの結果から、低酸素環境においてYTHDC2はHIF-1αの翻訳を促進していることが示唆された。 RNAヘリカーゼは遺伝子mRNAの5末端非翻訳領域(5’UTR)の二次構造を解くことで翻訳を促進することが知られている。データベースによる解析により、HIF-1α mRNAの5’UTR は平均的なmRNAの5’UTRに比べて、複雑な二次構造を形成しやすいことが示された。そこで、YTHDC2がHIF-1α mRNAの5’UTRの二次構造を解くことで翻訳を促進しているか否かを解析するため、ルシフェラーゼレポーターアッセイを応用して次の実験を行った。まず、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターのプロモーター領域とホタルルシフェラーゼ遺伝子領域の間にHIF-1α mRNAの5’UTRを挿入した。このベクターからホタルルシフェラーゼ遺伝子のmRNAが転写されると、HIF-1α mRNAの5’UTRと同じ二次構造が形成される。したがって、YTHDC2が5’UTRの二次構造を解くことで翻訳を促進するならば、Y2-KD細胞ではこの二次構造が解けないので、sh-cont細胞と比べてホタルルシフェラーゼ活性が低下すると予想される。ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果、Y2-KD細胞ではsh-cont細胞と比べてホタルルシフェラーゼの活性が有意に低下した。この結果からHIF-1αの翻訳にはYTHDC2が必要とされていることが示唆された。 HIF-1αは低酸素環境で、上皮間葉系転換形質に関わる遺伝子群の転写に必要であるとされ、転移に重要な働きを持つ遺伝子である。YTHDC2がそれを標的としていることは、YTHDC2の転移促進作用の結果を強く支持するものであった。これらの結果から、RNAヘリカーゼYTHDC2がHIF-1αの翻訳を促進することで大腸癌細胞の転移に寄与すること、そしてYTHDC2が癌治療の予後予測因子や治療標的遺伝子になり得ることが示唆された。(参考論文(A), 2; Tanabe et al., Cancer Letters, in press)