著者

米澤 康滋

出版者

近畿大学先端技術総合研究所

雑誌

近畿大学先端技術総合研究所紀要 = Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University (ISSN:13468693)

巻号頁・発行日

no.20, pp.9-18, 2015-03

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[要旨] 高圧力下に生存する深海生物はその高圧力環境に適した進化を遂げている. その進化は細胞機能の殆どを司る蛋白質にも反映されていることが最近の研究から明らかとなって来た. 一般に常圧下(1気圧)に生存する蛋白質は高圧力下でその機能及び構造を変化させ多くの場合は機能が低下する. 従って高圧力下に暮らす生物(深海生物)の蛋白質は高圧力に対して最適な分子進化を遂げていることが予想される. このような背景のもと高圧力下での蛋白質構造機能を研究する実験及び理論的試みが世界中各地で進められている. 本研究では, 深海生物Moritella profunda のDHFR を, Escherichia coli のDHFR と比較することでその構造及び機能動態・構造揺らぎ, 及びその圧力依存性を様々な手法で解析した. その結果, 深海生物由来DHFR の構造揺らぎは高圧力下でも機能を失わないような独自な構造動態を示す進化を遂げていることを示唆する結果を得た. [Abstract] Organisms live in a variety of extreme environmental conditions such as high/low temperature, high salt concentration and also high pressure. For instance, a number of organisms have been so far discovered at deep sea. It is believed that the deep sea organisms have been evolved with adaptation to high pressure. In recent decades, proteins of the deep sea organisms have been isolated like those from thermophilic organisms. Here, in order to elucidate the adaptation mechanism to the high pressure, we have conducted extensive molecular dynamics simulation studies at high(2000 bar) and normal pressure conditions using DHFR from a deep sea organism Moritella profunda(mpDHFR). We also simulated DHFR from Escherichia coli(ecDHFR) for omparison. We took a trajectory from the simulations and performed several analyses involving RMSD, RMSF, Gyration and principle component analysis(PCA). We found that high pressure does not affect overall structure of DHFRs. However, large slow fluctuations that govern the functions of DHFR are significantly different between ecDHFR and mpDHFR, while the trajectory we used is rather short to sufficiently elucidate the result. The difference is likely to be caused from the E-helix fluctuation. The fluctuation differences should be responsible for the activity change of mpDHFR at high pressure.近畿大学先端技術総合研究所紀要編集委員会

著者

櫻井 一正 中田 翔貴 豊増 明博 橘 秀樹

出版者

近畿大学先端技術総合研究所

雑誌

近畿大学先端技術総合研究所紀要 = Memoirs of Institute of Advanced Technology, Kinki University (ISSN:13468693)

巻号頁・発行日

no.20, pp.31-41, 2015-03

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[Abstract] Oligomeric state of the actin interacting protein 2/D-lactate dehydrogenase protein 2( Aip2p/Dld2p)isolated from Saccharomyces cerevisiae was shown to be able to unfold the conformation of pathogenic highly aggregated polypeptides, and has been supposed to be a novel chaperone protein. However, the mechanism of the unfolding activity is little understood. Since experiments for the structure–function relationships of a protein require an efficient expression system, we attempted to use the methylotrophic yeast Pichia pastoris because of its ability of very high expression yield. Changing the vector/protein construct combinations, we examined the secretion expression system of P. pastoris with several Aip2p/Dld2p constructs as well as the intracellular expression system. We did not observe significant expression yields in any construct combinations. RT-PCR analyses revealed that mRNA coding Aip2p/Dld2p was successfully synthesized, suggesting that the structure of Aip2p/Dld2p is inherently unstable and susceptible to proteolysis of the cellular quality control system. [抄録]出芽酵母Saccharomyces cerevisiae から単離されたオリゴメリック蛋白質Aip2p/Dld2p は病原性の蛋白質異常凝集体を解きほぐす活性を持ち, 新規のシャペロン蛋白質であることが示唆されている. しかしながら, その解きほぐし活性の物理化学的メカニズムについてはほとんど調べられていない. 蛋白質の物理化学的解析や構造解析には数十ミリグラム程度の試料が必要であり, そのためには高効率の蛋白質発現系を要する. そこで今回, 我々は他の蛋白質で高収量が報告されているメタノール資化酵母Pichia pastorisによる大量発現を試みた. 種々のAip2p/Dld2p コンストラクト(全長体、N 末端欠損体, システイン→アラニン置換体)とベクター(細胞内発現系、分泌発現系)の組み合わせを試したところ, Aip2p/Dld2p をコードするmRNA の合成は見られたが, 蛋白質の発現は細胞内発現系でも分泌発現系でも見られず, さらに分泌発現系の場合の細胞内にも見られなかった. Aip2p/Dld2p の天然構造は非常に不安定で, ヘテロロガスな発現の場合, 翻訳直後に細胞内の品質管理機構によって加水分解を受けているのではないかと考えられる.近畿大学先端技術総合研究所紀要編集委員会