1 0 0 0 キノコ類の溶血タンパク質, ヘモリシンの分布と特徴
[目的] ヘモリシンは原形質膜に結合し膜孔を形成することにより細胞崩壊を引き起こすタンパク質であり, 細菌, 海産動物, キノコなどにその存在が知られている. キノコヘモリシンは扱いが難しく不明な点が多い. 本研究では, キノコ類のヘモリシンについてその分布, そしてエリンギとスギヒラタケのヘモリシンについていくつかの特性を明らかにした. <BR>[方法と結果] ヘモリシン活性は, ニワトリ保存血を使い, 等張液中で完全溶血の半分の溶血を起こすタンパク量を1HUとした. 分析用キノコは市販品あるいは青森県津軽地方で採取し, -80℃に貯蔵しておいた33科113種類のものを用いた. 凍結キノコを破砕後2倍量の抽出緩衝液(pH8.0)を加え, 遠心分離後, 上清の溶血活性を求めた. 予備実験でキノコの中には抽出時に活性がなく, そのまま1晩放置後活性化するものがかなりあることがあきらかになった. そこでキノコ抽出液を抽出直後のものと一晩放置したものとに分けて活性測定した. その結果, 調査した113種類のうち45種類に明らかな溶血活性が見られた. このうち11種類は1晩放置後に活性が観察された. テングタケ科に属するキノコは12種類中8種類に活性が見られたのに対し, イグチ科の12種類のキノコにはいずれにも活性が見られなかった. 最も活性が強いのは市販のエリンギで1640 HU/g, ついでドクツルタケ1429 HU/g, タマゴテングタケ486 HU/g, ニカワホウキタケ394 HU/g, ヒロヒダタケ71 HU/gの順であった. エリンギのヘモリシンは抽出時にすべて活性化しており, その後活性増加はみられなかった. 一方, スギヒラタケのものは抽出時には全く活性が見られなかったが,5時間後に最大活性(59 HU/g)を示した. エリンギのヘモリシンはきわめて熱に弱く37℃でも1時間後には失活し始めたが, スギヒラタケの不活性型ヘモリシンは20分間の煮沸処理でもキノコ中で安定であった.
- 著者
- 清水 哲哉 中津 亨 宮入 一夫 奥野 智旦 加藤 博章
- 出版者
- 日本応用糖質科学会
- 雑誌
- Journal of Applied Glycoscience (ISSN:13447882)
- 巻号頁・発行日
- vol.51, no.2, pp.161-167, 2004 (Released:2008-03-24)
- 参考文献数
- 28
- 被引用文献数
- 1 2
エンドポリガラクツロナーゼ(EndoPG)は,inverting型の加水分解酵素であり,その触媒機構の詳細は不明であった。本研究では,リンゴ銀葉病菌(Stereum purpureum)の病徴発現蛋白として単離されたEndoPG Iを用いて触媒機構の解明を目的としてX線結晶構造解析を行った。イオンスプレー型質量分析装置を用いたEndoPG Iの糖鎖修飾の分析結果からEndoPG Iの結晶化には,3種のアイソフォーム,EndoPG Ia,Ib,Icのうち糖鎖の最も少ないEndoPG IaをEndoHで糖鎖切断した脱糖鎖型EndoPG Iaを用いた。この脱糖鎖型EndoPG IaをPEG 4000を沈殿剤に用いたハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶化した。得られた結晶は,空間群P1に属し,格子定数はa=37.26 Å,b=46.34 Å,c=52.05 Å,α=67.17°,β=72.44°,γ=68.90°であった。この結晶を用いて大型放射光施設SPring-8によりX線回折実験を行った。結晶構造の決定は,多波長異常分散法で行った。SPring-8で収集したデータを用いて初期位相を決定し,最終的に0.96 Å分解能でR値11.4%,Rfree値14.0%という超高分解能のEndoPG Iの構造モデルを得た。得られたEndoPG Iの構造は,10回の完全ターンの平行β-へリックス構造であった。さらに反応生成物であるガラクツロン酸(GalA)を1分子を含むbinary複合体と2分子含むternary複合体の結晶構造を1.00 Åおよび1.15 Å分解能で決定した。binary複合体において1分子のピラノース型(GalpA)の結合がみられた。GalpAの結合位置は,活性残基と推定されているAsp153,Asp173,Asp174の還元末端側にあたることから,GalpAは+1サブサイトに結合していると考えられた。一方,ternary複合体においては,GalpAの他に,フラノース型のGalfAの結合がみられた。GalfAの結合位置は,活性残基の非還元末端側にあたる-1サブサイトと決定された。+1サブサイトでは,三つの塩基性残基,His195,Arg226,Lys228がGalpAのカルボン酸の結合に関与していた。一方,-1サブサイトでは,特異なcis型のペプチド結合がGalfAのカルボン酸の認識に関わっていた。そこで,二つのガラクツロン酸の結合状態を基に,基質の-1,+1結合した2量体部分のモデルを構築し,EndoPG Iの反応機構を検討した。まず,Asp173は切断される基質モデルのグリコシド結合と直接水素結合しうる位置にあった。したがって,Asp173はグリコシド結合にプロトンを供給する一般酸触媒残基と確認された。一方,Asp153とAsp174は,基質のアノマー炭素を求核攻撃すると考えられる水分子と水素結合していた。このことから,Asp153あるいはAsp174が水からプロトンを引き抜き活性化する一般塩基触媒残基と予想された。