3 0 0 0 OA 筋肉内投与における脂質ナノ粒子コレステロール含有量のタンパク発現分布への影響
【目的】mRNA封入脂質ナノ粒子(mRNA-loaded Lipid Nanoparticle; mRNA/LNP)は、新型コロナウイルスのワクチンとして筋肉内投与により世界的に使用されている。mRNA/LNPは生体内で分解されやすいmRNAを安定に保持し細胞質まで送達できるという利点があり、その機能性はmRNA/LNPの脂質構成に起因する。一方で、LNPは肝への集積、高いタンパク発現が知られており、肝毒性が懸念される。これは、筋肉内投与されたLNPが筋肉から肝臓へ到達するまで血中で安定な状態であるためと考えられる。そこでLNP構成脂質のうち、脂質膜の安定性に寄与するコレステロールの含有量を減らすことでLNPを不安定化し、筋肉から肝臓へ到達する前に崩壊させることができるのではないかと仮説を立てた。本研究では、コレステロール含有量を減少させたmRNA/LNPを作製し、細胞およびマウス筋肉内に投与後、タンパク発現を比較検討した。【方法】脂質組成のうちコレステロール含有量を60, 40, 20, 10 mol%としたluciferase mRNA/LNPを作製し、その物性について粒子径とmRNA封入率の評価を行った。作製したLNPをmRNAが0.1 µg/wellとなるようにHepG2細胞に添加し、luciferase発現を評価した。次に、ddY雄性マウス右大腿部筋肉に2 µgのmRNA/LNP投与し、4.5時間後に筋肉と肝臓を摘出し、luciferase発現を評価した。【結果】Luciferase活性測定の結果から、細胞ではコレステロール含有量の異なるmRNA/LNP間でluciferase発現は同程度であった。一方、マウスではコレステロール含有量の低いmRNA/LNPにおいて、肝臓での遺伝子発現と相対的に比較して、投与部位である筋肉でluciferase発現が有意に高かった。【結論】LNPの脂質組成のうちコレステロール含有量を減少させると、肝臓におけるluciferase発現を抑えられることが示唆された。本結果は、今後のmRNA/LNPの製剤設計において有益な基礎的知見となることが期待される。
1 0 0 0 OA mRNA封入脂質ナノ粒子の安定性、物理化学的性質、タンパク質発現の相関の評価
【目的】新型コロナウイルス感染症(COVID-19)の感染・重症化予防において、新規プラットフォームであるmRNA封入脂質ナノ粒子(mRNA-LNP)ワクチンの高い臨床効果が実証された。mRNA-LNPワクチンの保存方法について、企業から提示される情報はあるが、様々な条件下での保存安定性についての系統的な情報はほとんどない。そこで我々はmRNA-LNPの物理化学的性質や細胞レベルでの発現を指標に、mRNA-LNPの安定性と物理化学的性質、タンパク質発現との相関について評価した。【方法】ホタルルシフェラーゼmRNA(fLuc-mRNA)を封入したLNPをマイクロ流体法により調製した。保存条件の検討項目は保存温度、振動条件、光安定性、バイアルからの採取とした。各条件下での物理化学的性質は、平均粒子径・多分散指数PdI・mRNA封入率により評価した。また、ヒト肝がん由来細胞株HepG2細胞に対してfLuc-mRNA-LNPを添加し、ルシフェラーゼ発現量を比較した。【結果】保存温度の検討では、対照群とした4 ℃保存群におけるLNPの平均粒子径100 nm程度に対し、-80 ℃保存群では平均粒子径1,500 nm程度の凝集体が認められた。同様に振動条件の検討では、ボルテックス5分間振動群で平均粒子径700 nm程度の凝集体が認められた。これらの物理化学的性質が変化したmRNA-LNPについてはタンパク質発現活性が有意に低下した。一方、光安定性の検討において、光安定性試験ガイドライン規定の120万lx・hr曝露群ではmRNA-LNPの物理化学的性質の変化は認められなかったが、タンパク質発現活性は顕著に低下した。【考察】mRNA-LNPのタンパク質発現活性は、温度や振動で変化したLNPの物理化学的性質の変化だけでなく、内封mRNAの生物活性が変化した可能性が考えられる光曝露の影響にも相関することが示された。mRNA-LNPとしての保存安定性において、LNPの物理化学的性質に加えて、mRNA-LNPのタンパク質発現活性を同時に評価する重要性が示唆された。