1 0 0 0 OA 培養心室細胞由来基質上でのES細胞の分化促進による 心室モデルの創出
本研究は、ES/iPS 細胞の心筋症治療の早期実現における二つの重要な課題:心筋細胞への効率的分化誘導と体外での再生組織の構築、を取り組んで、幹細胞工学、タンパク質工学及び細胞組織工学の融合により、新たな細胞分化培養基質支持層を開発し、この支持層上にマウスES 細胞の分化促進と心筋組織単層の作成を行い、多数単層の積層によって心筋再生組織を構築した。上記の実験研究により、ES 細胞の心筋細胞への分化誘導、培養基質の力学特性およびそのES 細胞の分化に及ぼす影響、並びに体外心筋再生組織構築における新知見を得、課題の更なる進展に関する重要な方法を示した。
本研究では、従来の細胞組織工学的な手法による構築したコラーゲンゲル足場での心筋再生組織を基づいて、新しい技法・改進を開発・実現し、生体心筋組織拍動特性を有する心筋再生組織を作った。3年間の研究活動によって、以下の成果を得た。1.体外培養ラット胎児心筋細胞の遺伝子発現の比較実験によって、培養心筋細胞における心筋細胞の分化・成熟に係る重要な伝写因子であるSRFとmyocardinおよび心筋組織介在板の構成を司るN-cadherinとconnexin43の発現低下を示した。この知見に基づき、遺伝子転移技法によって、N-cadherinの強化発現を促す、心筋細胞間の相互作用を強化することを試みた。2.3次元コラーゲンゲル足場の添加物による高浸透性化、並びに培養液供給と老廃物代謝の改善を実現した。4種類の添加物に対して、それぞれの混入実験を行い、その内heparinとalbuminが足場のglucose透過係数を約2倍に上がることから高浸透性に最も有効であることを判明した。3.心筋再生組織構築の各々の過程により詳細な検討・最適化を行った。その内二つ重要な処理は:i)心筋採取および組織構築におけるコラーゲンナーゼの残留効果を無くすために培養液にcysteineの添加が有効である;ii)ゲル形成の過程に、ゲルに埋め込む心筋細胞の沈殿による不均等性を防ぐためにゲル形成直後のゲル反転が必要である。4.新型電気一応カバイオリアクタを開発した。従来のバイオリアクタと違って、新型における応力の印加は外部から能動的な方式ではなく電気刺激による再生組織の収縮に伴う収縮応力と収縮ひずみの自然登生である。これによって、より実際の心筋組織収縮に模擬することができ、電気刺激と応力印加の協調も自然に解決された。5.再生心筋組織の拍動特性を解明するために、独自の拍動変位一拍動力解析法を開発した。6.以上の方法によって、構築した3次元心筋再生組織はその拍動力が約16倍に向上させ、最大収縮ひずみ速度と最大収縮力が対応する生体内の心筋組織拍動特性と似た特性を有している。