著者

卜部 格

出版者

公益社団法人日本生物工学会

雑誌

醗酵工学会誌 : hakkokogaku kaishi (ISSN:03856151)

巻号頁・発行日

vol.64, no.2, pp.77-97, 1986-03-25

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1. An NAD derivative carrying a vinyl group was copolymerized with acrylamide or methacrylamide, and various water-soluble macromolecular NAD derivatives (polymeric NAD derivatives) were obtained. I investigated the coenzymic properties of the polymeric NAD derivatives and concluded that smaller NAD derivatives and lower NAD contents in the polymer chain had higher cofactor activity.2. Poly(ethylene glycol)-bound NAD (PEG-NAD) was prepared by coupling N^6-(2-carboxyethyl)-NAD to one termial of α, ω-diaminopoly(etylene glycol) with water-soluble carbodiimide. The kinetic properties of NAD(H), N^6-(2-carboxyethyl)-NAD(H) and PEG-NAD(H) were investigated with various dehydrogenases from different sources.3. NADP derivatives alkylated at the 2'-phosphate and/or 6-amino groups of the adenosyl moiety were prepared, and the effects of these modifications of NADP on its cofactor activity for various dehydrogenases were investigated. Then, poly(ethylene glycol)-bound NADP (PEG-NADP) was prepared by selective alkylation of the 6-amino group of NAD. PEG-NADP has good cofactor activity for some dehydrogenases but not for isocitrate or glucose dehydrogenases.4. The kinetic properties of a continuous enzyme reactor containing rabbit muscle lactate dehydrogenase, horse liver alcohol dehydrogenase, and PEG-NAD were investigated experimentally and theoretically. The steady-state behavior of the enzyme reactor was explained semi-quantitatively by a simple kinetic model. The operational stability of a continuous enzyme reactor containing PEG-NAD and thermostable dehydrogenases was also studied.

著者

卜部 格 根来 誠司 島 康文 四方 哲也

出版者

大阪大学

雑誌

基盤研究(B)

巻号頁・発行日

1997

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競争的共存が起こる簡単化した系を用いて、タンパク質分子に対して変異と選択を繰り返すと、それをコードしている塩基配列や機能は変化することができるのだろうか。このことをE.coli内の1遺伝子であるグルタミン合成酵素遺伝子に対して変異と選択を繰り返す実験室内進化系を構築することによって観察した。そして、その遺伝子に対する分子系統樹を作成し、塩基配列および分子機能の変化過程を観察した。また、どの配列をもったものが全体の何割を占めるのかという情報から、集団構造の変化を示した。その結果、グルタミン合成酵素をコードする塩基配列と活性は集団内に2種類以上の異なった配列、違った活性を保持しながら変化し、多様化していくことが観察された。集団構造の変化から、それぞれの配列を持つ菌体の増殖速度は、集団がどういった配列を持ったもので構成されているかによって変化することが示された。さらに、実験室内進化系では、その時々の株を-80℃で保存することが可能である。そのため、一度実験室内進化系で消失した株をその後の変異と選択との繰り返しで残った集団と競争実験することが可能である。そこで、実験室内進化系の途中段階で消失した変異体と後の世代の集団と競争させた結果、実験室内進化系の途中で消失した株は、後の世代の集団と安定して共存した。このことは、個々の菌体が持つ増殖能が培養に用いた培地、温度等の外部環境によって決まっているのではなく、集団構造に依存して変化することをより強く示している。本研究では、E.coli内のグルタミン合成酵素に変異と選択をかけるサイクルを繰り返す実験室内進化系において、その酵素が多様性を保ちながら変化することが観察された。