1 0 0 0 OA 体外受精マウス胚に使用した培養液中のcell free DNA量の検討
- 著者
- 小澤 南 右田 王介 清水 直樹
- 出版者
- 学校法人 聖マリアンナ医科大学医学会
- 雑誌
- 聖マリアンナ医科大学雑誌 (ISSN:03872289)
- 巻号頁・発行日
- vol.50, no.4, pp.163-172, 2023 (Released:2023-05-16)
- 参考文献数
- 20
緒言:日本においても2020年に6万人近い新生児が生殖補助医療(ART)の恩恵をうけて出生している。体外受精した胚の状態を評価する方法として,胚生検による着床前遺伝子検査が,すでに臨床応用されている。しかし,その侵襲が胚変性を惹起する可能性が残されている。培養液中に認められるcell free DNA(cfDNA)は生検にかわり着床前診断を行う胚の無侵襲な評価方法となりうる。今回,溶液中のcfDNAを回収し,定量することで解析の実用性を検討した。方法:マウス卵を体外受精させ,胚盤胞期胚を得るために5日間培養した。胚盤胞期胚に発育した胚の培養液のDNAの回収を試みた。マウス脳組織DNAをコントロールに用い,リアルタイムPCRを使用した検量線法による溶液中のDNA定量を行った。結果:個別の培養液のDNAは微量であった。5日目の培養液中に平均900 pg前後のDNAが含まれていると推定した。考察:エタノール沈殿処置を行い,マウスの培養液からcfDNAが回収可能となった。cfDNAは培養細胞の状態を無侵襲に評価でき,胚の評価に応用できる可能性がある。一方,胚培養液中のcfDNAはごく微量であり,その回収に当たっては,その後の解析に合わせた精製方法の選択が必要と考えられた。
1 0 0 0 OA 先天性代謝異常の遺伝子検査システムの開発
- 著者
- 右田 王介
- 出版者
- 国立成育医療センター(研究所)
- 雑誌
- 若手研究(B)
- 巻号頁・発行日
- 2006
先天代謝異常症では、近年造血幹細胞移植や酵素補充療法といった根本的治療が可能となり、早期診断が急務となってきている。しかし、病因遺伝子が明らかであり遺伝子検査が未発症もしくは発症早期の診断の有力な根拠となりうるにもかかわらず、実際的な低コスト・迅速な遺伝子検査体制については、いまだ検討段階にある。本研究では遺伝子変異の新しい検査方法について検討し、将来の遺伝子検査体制の開発をめざした。・遺伝子変異スクリーニング法の確立10の遺伝子(ATP8B1, ABCB11, JAG1, OTCD, IDS, GUSB, IDUA, FGFR3,DMD,FCMD)についてPCR増幅法を確立した。簡便な検査を目指すため全エクソンに対し温度設定、使用ポリメラーゼなどについて、まったく同一条件としたPCR条件の確立をめざした。全てのアンプリコンを全く同一の条件に統一つることはできなかったが、1遺伝子あたり1〜3条件に集約できた。これにより、予めPCR反応に必要なプライマーのセットを準備し、患者DNA検体とPCR試薬の混合物を添加するだけで半自動的に遺伝子変異探索の検討ができるようになった。・スクリーニング法の評価これまでに遺伝子解析が行われた既知の遺伝子変異をもつDNA検体を用いて、DHPLC法およびリシークエンシング・アレイ法による変異検索の検出検討を行った。直接シーケンス法による遺伝子変異の検出率と比較した。研究申請段階では、未確立であったアレイ技術によるリシークエンシング・アレイ法による解析についても検討し、キャピラリー式の直接シークエンス法と同等の検出力をもつことが確認できた。・遺伝子検査システムの確立これら新規遺伝子解析法を併用した遺伝子検査システムを、遺伝子変異が未知の検体へ応用を開始した。全国の医療施設からのムコ多糖症、OTC欠損症など受け入れて検査を開始した。・遺伝子検査システムの応用本研究では、PCR条件を画一化することによって半自動化した検査体制の確立が期待できることを検証した。各疾患の病因遺伝子にある全エクソンのプライマーセットをあらかじめ準備したPCR用プレートを作製し、臨床的にある遺伝性疾患が疑われた際に、患者DNAサンプルとPCR試薬のミックスをこのプレートに投入することで、遺伝子の検討を迅速に行える。この方法は、アレイ技術による解析にも応用でき有用な方法と考えられた。今後もより迅速で確実な先天疾患の遺伝子診断システムの拡充にむけた検討が必要と思われる