著者

錦見 盛光 幸村 定昭

出版者

(財)応用生化学研究所

雑誌

一般研究(C)

巻号頁・発行日

1989

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ヒトはアスコルビン酸生合成経路の最終段階を触媒するグロノラクトン酸化酵素(GLO)を欠損しているため、ビタミンCを合成できない。本研究において、ヒトにおけるGLO欠損の原因を遺伝子レベルで解明することを目指し、次のような結果を得た。ラット肝臓のGLOに対するcDNAをプロ-ブとして用い、種々の動物ゲノムDNAをサザンブロット法で分析した結果、ヒトはGLO遺伝子を持つが、ハイブリダイゼ-ションの強さは、他のGLO活性を有する動物の場合に比して弱いことが分かった。そこで、ヒトとラットのGLO遺伝子を塩基配列の上で比較するため、ラムダファ-ジで作ったヒトおよびラットのゲノムDNAライブラリ-から同遺伝子のクロ-ニングを行い、得られたクロ-ンの塩基配列を決定した。ラットの重りを持つ三つのクロ-ンについて調べたところ、ラットのGLO遺伝子は20キロベ-ス以上の長さを持ち、12個のエキソンと11個のイントロンより構成されることが明らかとなった。また、ヒトの陽性クロ-ンの一つはゲノムDNAのサザンブロットで認められる約12キロベ-スのEcoRI断片を含み、その中にラットのGLO遺伝子の3個のエキソンに対応する塩基配列が見出された。その内一つの配列では、ラットのエキソンの5′側でかなりの部分が欠失していた。108塩基からなるエキソンについてラットとヒトの間で配列を比較すると、ヒトで1塩基の欠失があり、両者の相同性は75%であった。アミノ酸配列で比較すると相同性は64%と低く、しかも変化の大きい置換が数多く認められた。これらの事実は、ヒトのGLO遺伝子が進化の過程で機能を失った後、選択圧を受けることなく変異を蓄積して来たことを示唆する。即ち、ヒトのGLO遺伝子は偽遺伝子の状態でヒトゲノム中に存在していることが判明した。

著者

錦見 盛光 河合 敏秀

出版者

(財)応用生化学研究所

雑誌

一般研究(C)

巻号頁・発行日

1990

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ヒトやサルはビタミンCを生合成することができないため、このビタミンを食物より摂取せねばならない。その原因がビタミンC合成経路で働くグロノラクトン酸化酵素(GLO)の欠損にあることが分っているので、これらの動物の細胞へGLOのミニ遺伝子を導入しGLOの発現を試みた。ラット肝臓GLOのcDNAを発現ベクタ-pSVLの後期プロモ-タ-と後期ポリA付加部位の間へ挿入した構築体を作製した。これをアフリカミドリザルの腎臓由来のCOSー1細胞へリン酸カルシウム共沈殿法で導入し、抗ラットGLOウサギ抗血清を用い免疫組織化学的方法で細胞を染色したところ、5ー10%の細胞でGLOタンパク質が発現されていることが分った。発現されたGLOタンパク質が酵素活性を持つことを高速液体クロマトグラフィ-用いるGLO活性測定法により確認した。さらに、COSー1細胞で発現されたGLOがラット肝臓のGLOと同じ分子量を有することをウエスタンブロット法で明らかにするとともに、ミクロソ-ム画分に局在することを細胞分画法で調べた。また、恒常的にラットGLOをヒト由来のHeLa細胞で発現させるため、マウスMoloney白血病ウイルスのLTRとバクテリアのネオマイシン耐性遺伝子をpBR322へ組み込んだベクタ-(N2)のXhoIサイトへ、SV40の前期プロ-モ-タ-の下流へラットGLOのcDNAをつないで連結した。得られた構築体をHeLa細胞にリン酸カルシウム共沈殿法によりトランスフェクトしG418に耐性を示す細胞を得た。その細胞がGLOを発現することを免疫組織学化的に染色して確認した。現在、GLO活性を発現するようなクロ-ンを得る試みを行っている。