著者

錦見 盛光 幸村 定昭

出版者

(財)応用生化学研究所

雑誌

一般研究(C)

巻号頁・発行日

1989

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ヒトはアスコルビン酸生合成経路の最終段階を触媒するグロノラクトン酸化酵素(GLO)を欠損しているため、ビタミンCを合成できない。本研究において、ヒトにおけるGLO欠損の原因を遺伝子レベルで解明することを目指し、次のような結果を得た。ラット肝臓のGLOに対するcDNAをプロ-ブとして用い、種々の動物ゲノムDNAをサザンブロット法で分析した結果、ヒトはGLO遺伝子を持つが、ハイブリダイゼ-ションの強さは、他のGLO活性を有する動物の場合に比して弱いことが分かった。そこで、ヒトとラットのGLO遺伝子を塩基配列の上で比較するため、ラムダファ-ジで作ったヒトおよびラットのゲノムDNAライブラリ-から同遺伝子のクロ-ニングを行い、得られたクロ-ンの塩基配列を決定した。ラットの重りを持つ三つのクロ-ンについて調べたところ、ラットのGLO遺伝子は20キロベ-ス以上の長さを持ち、12個のエキソンと11個のイントロンより構成されることが明らかとなった。また、ヒトの陽性クロ-ンの一つはゲノムDNAのサザンブロットで認められる約12キロベ-スのEcoRI断片を含み、その中にラットのGLO遺伝子の3個のエキソンに対応する塩基配列が見出された。その内一つの配列では、ラットのエキソンの5′側でかなりの部分が欠失していた。108塩基からなるエキソンについてラットとヒトの間で配列を比較すると、ヒトで1塩基の欠失があり、両者の相同性は75%であった。アミノ酸配列で比較すると相同性は64%と低く、しかも変化の大きい置換が数多く認められた。これらの事実は、ヒトのGLO遺伝子が進化の過程で機能を失った後、選択圧を受けることなく変異を蓄積して来たことを示唆する。即ち、ヒトのGLO遺伝子は偽遺伝子の状態でヒトゲノム中に存在していることが判明した。

著者

錦見 盛光 河合 敏秀

出版者

(財)応用生化学研究所

雑誌

一般研究(C)

巻号頁・発行日

1990

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ヒトやサルはビタミンCを生合成することができないため、このビタミンを食物より摂取せねばならない。その原因がビタミンC合成経路で働くグロノラクトン酸化酵素(GLO)の欠損にあることが分っているので、これらの動物の細胞へGLOのミニ遺伝子を導入しGLOの発現を試みた。ラット肝臓GLOのcDNAを発現ベクタ-pSVLの後期プロモ-タ-と後期ポリA付加部位の間へ挿入した構築体を作製した。これをアフリカミドリザルの腎臓由来のCOSー1細胞へリン酸カルシウム共沈殿法で導入し、抗ラットGLOウサギ抗血清を用い免疫組織化学的方法で細胞を染色したところ、5ー10%の細胞でGLOタンパク質が発現されていることが分った。発現されたGLOタンパク質が酵素活性を持つことを高速液体クロマトグラフィ-用いるGLO活性測定法により確認した。さらに、COSー1細胞で発現されたGLOがラット肝臓のGLOと同じ分子量を有することをウエスタンブロット法で明らかにするとともに、ミクロソ-ム画分に局在することを細胞分画法で調べた。また、恒常的にラットGLOをヒト由来のHeLa細胞で発現させるため、マウスMoloney白血病ウイルスのLTRとバクテリアのネオマイシン耐性遺伝子をpBR322へ組み込んだベクタ-(N2)のXhoIサイトへ、SV40の前期プロ-モ-タ-の下流へラットGLOのcDNAをつないで連結した。得られた構築体をHeLa細胞にリン酸カルシウム共沈殿法によりトランスフェクトしG418に耐性を示す細胞を得た。その細胞がGLOを発現することを免疫組織学化的に染色して確認した。現在、GLO活性を発現するようなクロ-ンを得る試みを行っている。

著者

錦見 盛光

出版者

公益社団法人 日本ビタミン学会

雑誌

ビタミン (ISSN:0006386X)

巻号頁・発行日

vol.81, no.1, pp.1-8, 2007-01-25 (Released:2017-10-10)

参考文献数

35

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L-Ascorbic acid is synthesized by animals and plants, and its analogues in fungi. Studies in the 1950s showed that scurvy-prone species, such as humans, other primates, and guinea pigs, do not possess L-gulono-γ-lactone oxidase, the terminal enzyme of the L-ascorbic acid biosynthetic pathway in animals. We first cloned a cDNA for this enzyme of rat, with which the isofunctinal enzymes of plants and fungi were later shown to be homologous at the gene level. Using the cDNA as a probe, its related DNA sequences of human and guinea pig were cloned and their gene structures were disclosed. Of note is the tremendous deterioration of the genes such as deletion of exons and nucleotide(s), nonconformity to the GT/AG rule at the intronexon junction, and occurrence of stop codons as well as a large number of substations at the amino acid level. In contrast, the genetic abnormality of osteogenic disorder Shionogi (ODS) rat was found to be due to a single missense mutation in the L-gulono-γ-lactone oxidase gene. Recent our study revealed that the knockout mouse deficient for senescence marker protein-30 was subject to scurvy when fed a vitamin C deficient diet. As a matter of fact, this protein was proven to be the gluconolactonase that catalyzes the penultimate step of the L-ascorbic acid biosynthetic pathway.

著者

錦見 盛光 河合 敏秀 八木 國夫

出版者

公益社団法人 日本ビタミン学会

雑誌

ビタミン (ISSN:0006386X)

巻号頁・発行日

vol.66, no.11, pp.655-660, 1992-11-25 (Released:2018-03-17)

被引用文献数

2

著者

錦見 盛光 松井 仁淑

出版者

和歌山県立医科大学

雑誌

重点領域研究

巻号頁・発行日

1995

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ヒトを含む霊長類はビタミンCの合成ができないが、その原因は合成経路で働くグロノラクトン酸化酵素(GLO)の欠損による。われわれは、機能を有するラットのGLO遺伝子と機能を失ったヒトのGLO遺伝子の塩基配列をすでに報告した。本研究では、ヒトの遺伝子において特定された4つのエキソン(VII,IX,X,XII)の配列についてラットの配列と比較し分子進化学的検討を加えた。ヒトのGLO遺伝子における非同義置換は、遺伝子が機能をなくした後は選択圧を受けないため、同義置換と同じ頻度で生じてきたと推定される。この推定が正しいと仮定して、ヒトとラットの間の非同義サイトにおける置換数の値(0.16)と霊長類の同義サイトの進化速度(2.3×10^<-9>/サイト/年)とから、ヒトがGLOを失った時期は約7,000万年前以後と推測した。また、チンパンジーとマカクのゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行い、エキソンXを増幅して得られたDNAの塩基配列を決定した。その結果、ヒトの配列と比べたホモロジーはそれぞれ97.6%と89.7%であった。これらの値は霊長類の祖先がGLOを失って以降、GLO遺伝子で塩基置換がランダムに起きていることを示しており、この遺伝子が進化の中立説を説明する恰好の例であることが分かった。さらに、ヒトの配列においてエキソンXIは欠失していることが分かっているので、この欠失が類人猿においても認められるか否かを調べた。ヒト、チンパンジー、およびゴリラのゲノムDNAを鋳型として、エキソンXからエキソンXIIにわたる領域をPCRによって増幅した結果、いずれも同一サイズ(23.5kbp)のDNAが得られたことから、エキソンXIの欠失はこれらの類人猿の分岐以前に起きたものと想定された。