【目的】ヒト末梢単核球をSPYMEG細胞とPEG法で融合しヒト抗体産生ハイブリドーマを作製する方法によりヒトインフルエンザウイルスに対する抗体作製が可能であることを示してきた(BBRC387(2009)180-185)。本法を用いて、血友病A患者に発生したインヒビター抗体の作製を目的とした。【結果】細胞融合には化学的なPEG法を用いた。コロニー形成率は10~30%と低かった。ハイブリドーマ培養上清の抗体をELISA法によりスクリーニングしたがインヒビター陽性ウェルは確認できなかった。感染症患者から抗インフルエンザウイルス抗体を作製したようにはインヒビター抗体が得られなかったことから、改善が必要と考え、(1)血中抗体の力価の差、(2)融合効率の改善、(3)抗体産生細胞の濃縮に関し検討した。(1)は高力価の患者を利用することで対応可能とした。(2)の対応は、電気的融合法を検討した。電気的手法は細胞への傷害が少なく、PEG法より高効率で抗体作製ができるとされる。SPYMEGでは電圧を400V以上にすることにより融合効率をPEGと同程度(100%融合率)に高めることに成功した。しかし本条件下では抗体産生率がPEG法に比べ約1/2と著しく低くPEG法を踏襲した。次に(3)であるが、血友病A患者からの融合成績では、融合初期に陽性クローンが確認できたが、培養途中で産生能を失うことが主な原因であった。そこで、抗原をコーティングした磁気ビーズを用い、抗体産生細胞を選択する方法を検討し、細胞を特異的に好成績であった。【考察】電気融合法はPEG法を超えなかったので、PEG法にて血友病A患者からのインヒビターの作製を試みたが、最終的に陽性クローンは得られなかった。今後、さらなる改善策として、磁気ビーズによる細胞の濃縮と、ウアバインなどによる遺伝子の脱落を抑えるなどの処理を行い、抗体産生を安定化させ、高力価のインヒビター陽性患者からの末梢単核球を調製し例数を多く試みる必要がある。
フュージョンパートナー細胞SPYMEGを用いてヒトのモノクローナル抗体が作製できるか否かを検討した。健常人の末梢血よりリンパ球を得てSPYMEGとPEG法を用いて融合させ、HAT存在下にてハイブリドーマ細胞を培養した。融合細胞を768ウエルに播種したところ、コロニー形成率は平均28%(2回の融合)であった。IgG産生能をサンドイッチELISAにて測定した結果、コロニーが形成されたウエル中27%で陽性であった。これは既報のパートナー細胞Karpasを用いた成績に極めて近い値であった。ヒトのIgGを産生している細胞を限界希釈し単クローンにし、IgGを精製したところ、H-鎖、L-鎖ともに発現しており、完全なIgGが合成されていることが分った。抗体産生能はハイブリドーマに依存するがよく産生するクローンで2〜10μg/ml程度であった。ハイブリドーマはセルバンカーを用いて1ヶ月凍結保存し、その後再び培養を再開しても抗体産生能は凍結前に比べ変化はなかった。この結果から、かなり安定したヒトのモノクローナル抗体が作製できることが明らかになった。そこで、ヒトの特異的モノクローナル抗体を作製するために、ヒトに投与できる抗原としてインフルエンザワクチンを用いた。インフルエンザワクチン投与した場合、投与後1ヶ月以内に末梢血リンパ球を得てSPYMEGと融合させ、HAT存在下にてハイブリドーマ細胞を培養した。またインフルエンザに自然感染した健常人についても検討した。融合細胞を384ウエルに播種し、インフルエンザワクチン抗原AとBの混合液ををELISAプレートにコートし、スクリーニングを行なった。その結果、自然感染の健常人からのリンパ球を用いたときインフルエンザ抗原に陽性に反応するモノクローナル抗体が14クローンが陽性であり、最終的に2クローンが得られた。インフルエンザワクチンを投与したとき、121クローンが陽性であった。このうち最終的に12クローンが得られた。同手法を用いて、血小板のGPIIb/IIIa複合体に対する抗体を産生している自己免疫疾患患者から抗体の作製を行なった。その結果、2クローンが健常人の血小板に反応しIIb/IIIaを免疫沈降してくることがわかった。これらの結果から、SPYMEGはヒトのモノクローナル抗体の作製が可能でり、臨床と基礎医学研究に役立つと考えられた。