著者

三谷 幸之介

出版者

公益社団法人 日本薬学会

雑誌

ファルマシア (ISSN:00148601)

巻号頁・発行日

vol.54, no.2, pp.150_1, 2018 (Released:2018-02-01)

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CRISPRなどの人工制限酵素が,本来の標的DNA配列以外の類似配列を認識して切断することによって生じるDNA変異のこと.それによって予期せぬ遺伝子に変異が入り,基礎研究では得られるデータに影響が出る可能性が,また臨床応用では細胞のがん化などに結びつく危険性が問題とされている.通常,オフターゲット部位は,対象生物のゲノム上で標的DNA配列と3〜4塩基のミスマッチを持つ配列をコンピューターで同定するが,実際に細胞内で生じる部位を反映していないとの報告もある.ゲノム編集を行った細胞でこれらのオフターゲット変異部位について集中的にシークエンシングして,変異が入っている頻度を決定する.

著者

三谷 幸之介 大林 富美 岸本 充弘

出版者

埼玉医科大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

2005

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本研究では、ウイルスベクターを利用した相同組換えにより染色体遺伝子を修復する究極の遺伝子治療法の開発を目的とする。1、アデノウイルスベクターヘルパー依存型アデノウイルスベクター(HDAdV)によるヒト細胞での相同組換え効率を検討するため、正常ヒト繊維芽細胞においてHPRT遺伝子座を標的とし、細胞あたり10^<-5>から10^<-6>の頻度で遺伝子ノックアウトを達成した。また、相同組換えによってファンコニ貧血A群(FANCA)遺伝子変異を修復する頻度を測定するために、正常FANCA遺伝子座の一部をコードするHDAdVを作製し、患者由来B細胞株(BCL)に感染させた。しかし、相同組換えによるFANCA遺伝子の修復も、染色体上のランダムな位置へのベクターの組み込みも、いずれも検出できなかった。2、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターHDAdVと同様に、HPRTノックアウトベクターとFANCA修復ベクターを構築した。宿主域の異なる各種AAVベクターを調製し、正常BCLを感染させたところ、1 x 10^<-5> - 6 x 10^<-6>の頻度で染色体に組み込まれた。そのうち、AAV2とAAV8由来のベクターで、細胞当たり1 - 2 x 10^<-6>の頻度でHPRTノックアウトを達成したFANCA患者由来細胞BCLに対しても、3 x 10^<-5>の頻度でHPRTノックアウトを得た。ヒト造血細胞における遺伝子ノックアウトは初めての例である。さらに、FANCA修復ベクターを用いて遺伝子修復を試みたが、修復細胞は検出されなかった。3、相同組換えの促進と非相同組換えの抑制の試みマウスHprt相同領域をコードするプラスミドDNAをマウスES細胞へエレクトロポレーションし、UV damage endonuqleaseの強制発現またはPARP1阻害剤での細胞処理による相同組換えの促進と、DNA-PKcs阻害剤の細胞処埋による非相同組換えの抑制を検討したが、いずれの場合も顕著な効果は認められなかった。4、今後の展望HDAdVに関しては、long PCRで相同配列をクローニングした際にエラー(変異)が入って相同組換えを阻害した可能性があるので、BACから直接クローニングする方法でベクターを再構築し、実験を行う予定である。また、FANCA陽性細胞の検出法の精度を改善して、AAVを用いて再実験を行う。