著者

山口 十四文 平井 俊朗 実吉 峯郎

出版者

帝京科学大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

2002

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強力かつ選択的なヌクレオシド・ヌクレオチド系テロメラーゼ阻害剤を獲得するための分子設計を行った。テロメラーゼは制がん剤の研究開発を行う際の恰好な標的酵素と考えられる。また、良い阻害剤はテロメラーゼの構造や機能を研究するための試薬として有用であると考えられる。まず、いくつかの糖部変換ヌクレオチドアナログのテロメラーゼに対する阻害効果を塩基部がチミンとグアニンの場合を比較しながら調べた。その中で、3'-アジド-2',3'-ジデオキシグアノシン(AZddG)5'-トリりん酸(AZddGTP)とカーボサイクリックオキセタノシンGトリりん酸(c-oxtGTP)などのいくつかのグアニンヌクレオチドアナログがチミンのものに比べて強い阻害効果を示した。特にAZddGTPが強い阻害を示し、阻害機構はdGTPに関する拮抗阻害とプライマー3'末端に取り込まれるための鎖伸長停止と考えられる。AZddGTPは、脊椎動物DNAポリメラーゼαおよびδに対する阻害は弱かったことから、テロメラーゼ選択的阻害剤といえる。次に、ヒトHL60培養細胞を用いて、数十日の長期間にわたるAZddG処理がテロメアDNA長および細胞増殖速度にどのような影響を及ぼすかを調べた。AZddGは再現性良くテロメアの短小化を引き起こした。また、細胞増殖への影響はそれほど顕著ではなかったが、わずかな増殖速度の低下が認められた。DNAポリメラーゼα阻害を作用機構とするアラビノルラノシルシトシン(araC)がAZddGの効果を増強するかどうか調べたが、特に観察されなかった。現在、既存の制がん剤の効果をAZddGが増強するかどうかを検討中である。

著者

実吉 峯郎 山口 十四文

出版者

帝京科学大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

1998

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生殖細胞およびトランスホームした細胞に活性が高く、複製に際してその末端部分を合成するテロメラーゼに着目し、その阻害剤の分子設計を行った。酵素としては、逆転写活性を有することでウイルス由来のそれとの比較は重要であり、生物寿命との関連、がんとの関連で注目されているにもかかわらず、酵素学的解析はほとんど行われていない。そこで、Stretch PCR法の条件を詳しく検討した結果、ヌクレオシドと関連する阻害剤候補物質のLineweaver-Burkプロットなどを用いた反応速度論的解析が可能となった。我々の研究室ですでに保有するL-dGTPおよびL-dTTPの阻害能をこの系で評価したところ、HIV逆転写酵素と比較してエナンチオ選択性が高いことが明らかとなった。我々が合成したdUTP類似体についてその5位に疎水性スチリル基を導入すると親和性が高まり、一方、HIV逆転写酵素を強く阻害することで有名なHEPT誘導体はテロメラーゼを全く阻害しないことも明らかとなった。以上の知見に基づいて、塩基部では、かさ高さ、疎水性、親水性、電気陰性度などを指標とした置換メチル基を有するアラUTP誘導体、糖部では、既に有効なアラビノース、ジデオキシリボースとの比較において従来全く試みられていないリキソースヌクレオシド誘導体を設計、合成した。今回ヒトHeLa細胞テロメラーゼを用いて検討したが、さらなる素材としてサクラマス精巣に高いテロメラーゼ活性を有することを見出したのでこれは今後の蛋白質化学的解析に発展することが期待される。

著者

実吉 峯郎 川口 健夫 山口 十四文

出版者

帝京科学大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

1996

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本研究では、まず、ヌクレオチドの酸素をメチレンに置き換え、りん酸エステルをメチレンホスホン酸にすることから始まる。そのため、既知の方法に従って、トリエチル亜りん酸をパラアルデヒドと反応させて得たヒドロキシメチルトリエチル亜りん酸としたのち、トシル化して鍵中間体とした。一方、L-アラビノースより出発して調製した、L-チミジンの直接的ホスホン酸化を色々な条件で試みたが、副生成物が多く実用的でないことが判明した。ついで、メチル-L-2-デオキシリボフラノシドと当該試薬を、水素化ナトリウム存在下反応させ、副生するジ置換体を分離後、3′-水酸基を塩化パラトルオイル処理により保護した。メチルジトルオイルデオキシリボシドのアノメリック位はエーテル溶媒中の塩酸ガスによるクロル化により、α体が選択的に析出してあとの反応に都合がよいが、今回の反応では、α体とβ体が混合物として得られた。そこで、トリメチルシリルチミンを用いていわゆる、Max-Hoffer反応を行ったあと、生じたαとβの異性体をシリカゲルカラムクロマトにより分離した。αとβの生成比は1:3であった。N_4-アセチルシトシンのシリル体でも同様な反応が進行したが、プリン系では、この縮合条件では、多くの異性体を生じ、相互に分離して目的物を得るにはいたらなかった。一方、1,2-イソプロピリデン-3-O-トシル-α-D-キシロフラノースをホスホネート化したあと、加酢酸分解に付し、トリメチルシリルチミンと縮合し、脱保護すると、エポキシド中間体を経て、アラTの5′-メチレンホスホネートに到達した。両者の燐部分の脱保護を行い目的物を得た。この方法を適用して、塩基部位のバリエーションを合成するとともに、すでに合成出来た化合物については、現在、単純ヘルペス1型、2型、サイトメガロウイルスに対する抗ウイルス活性を検定中である。

著者

実吉 峯郎 川口 健夫 山口 十四文

出版者

西東京科学大学

雑誌

一般研究(C)

巻号頁・発行日

1994

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申請時に提出した研究計画に基づき、まず、アラビノフラノシルシトシン-5′-モノりん酸(アラCMP)を出発材料とし、N4,2′,3′位の水酸基を無水プロピオン酸を用いてアシル保護した後、ピリジン中、塩化トリイソプロピルベンゼンスルフォニルと、対応するアルコール又は、フェノールと反応させ、脱保護、ダウエックス1(ぎ酸型)カラムクロマトグラフィーで精製し、a)フェニル、b)オルトクロロフェニル、c)パラノニルフェニル、d)フェノキシエチル、e)フェニルプロピルの各エステルを合成した。まず、3′→5′エキソヌクレアーゼ(ホスホジエステラーゼ)による酵素的水解に対する挙動を吟味したところ、いずれも、短鎖直鎖アルキルエステル(メチル、エチル、プロピル)と比較して、相対的に、水解速度は速く、その順番は、abcedであった。従って、芳香環に直結した水酸基を有するエステルが、この酵素にたいする親和性が高いと思われる。耐性細胞では、細胞膜の透過性が低下し、かつ、第1次りん酸化過程(salvage酵素)が欠落している可能性が示唆されているので、第一に細胞膜の透過を良くし、内部でエキソヌクレアーゼによってエステルの水解による、アラCMPの放出が行われることが望ましい。ついで、アラC感受性および耐性の培養ヒト癌細胞であるKB細胞を用いて上記化合物の検定を行ったところ、化合物cのみが、耐性株に対して増殖阻害を示した。cはアルキルフェノールエステルであり、側鎖ノニルグループによって、透過性とエステル酵素分解のかねあいがうまくいき、他の化合物にない挙動を示したと思われる。今後は、同様にアラC耐性に白血病細胞を用いて検定を行う予定である。膜透過性すなわち、細胞外からの取り込みには膜のトランスポートが関与しているので、その補助薬を開発することも耐性克服には有用であり、フェネチルデオキシウリジンとFUdRの系をモデルとしてその有効性を明らかとした。(発表論文)。さらに、りん酸エステルの類似体としてのホスホネートヌクレオシドについても一般的な合成法を確立しつつある。