著者

高田 達之 鳥居 隆三 土屋 英明 木村 博 木本 安彦 細井 美彦 入谷 明

出版者

滋賀医科大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

2001

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本研究は(1)サルES細胞を用いた遺伝子改変技術の確立と(2)そのES細胞由来の遺伝情報を有する産仔を得る、という2つの主目的からなっている。まず(1)の課題に関して、我々は世界に先駆けて遺伝子導入が困難とされたカニクイザルES細胞への蛍光蛋白GFP遺伝子の導入に成功した。そしてこのGFP発現カニクイザルES細胞(GFP-ES)がin vitro, in vivoにおいて内、外、中胚葉に分化し、多分化能を維持していることを明らかにした。さらにGFP-ES細胞を4-6細胞期のカニクイザル正常発生胚に注入すると、割球と混じり合って増殖し、キメラ胚盤胞を作る能力があることを証明した。すなわち目標であったサルES細胞を用いた遺伝子改変技術を確立することができた。さらにこの過程でsiRNAのサルES細胞への効率良い導入方法の開発にも成功し、サルES細胞において容易な遺伝子発現抑制方法を確立することができた。すなわちサルES細胞における遺伝子改変技術として、過剰発現系とその逆の発現抑制という2つの技術を確立することに成功した。次に2番目の課題に関して、このGFP-ES細胞を4-6細胞期の正常発生胚に注入後、レシピエント個体の卵管に移植し、キメラザルの作出を試みた。その結果、4頭の妊娠に成功し、1頭の正常仔の出産に成功した。この個体の皮膚、および血液における、明確なGFPの発現は認められなかったが、ゲノムにおけるGFP遺伝子の存在をPCR法により調べたところ、キメラであることが明らかになった。すなわち世界で初めてES細胞を用いたキメラザルを誕生させることに成功した。以上、本研究の結果、サルES細胞に遺伝子改変を行い、これを用いて遺伝子改変ザルを作製するための細胞工学的、発生工学的方法を開発し、必要な技術基盤を確立することができた。

著者

山崎 樹里 鳥居 隆三 土屋 英明

出版者

滋賀医科大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

2011

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当該年度は、卵巣刺激を施した成熟メスカニクイザルから採取された未成熟卵IF(germinal vesicle : GV、Metaphase I : MDを用いて、体外成熟培養法の確立、および体外成熟卵子の評価としての顕微授精を行った。体外成熟培養法の確立を目指し、TCM-199に10%-FBS、penicillin-strepmmycnを添加したものを基本培地とし、BDNF、GDNF、IGFI、EGF、RGF、Leptin、BstatiClの7因子添加の影響を調べた。また、ヒト可溶化羊膜(Human Solubilized Amnion products : HSAP)を培養器剤にコートして使用することで、ラミニン、ニドゲン、コラーゲンなどの影響を調べた。その結果、GV、MIどちらのステージにおいても、7因子の添加、およびHSAPの使用による体外成熟率の改善は見られなかった。また、体外成熟卵子の顕微授精の結果、高い受精率が得られた。しかし、体外培養により発生の確認を行った結果、全ての顕微受精胚が8細胞期~16細胞期で発生を停止した。そこで、体外成熟卵子の核成熟を確認するために、体外成熟卵子を固定、染色して核相を調べた結果、多くの卵子で核成熟が確認された。次に、体外成熟卵子の細胞質成熟を確認するために、ヒト卵子において、細胞質が成熟すると細胞質表面に整列する表層顆粒の分布を調べるために電子顕微鏡観察を行った。その結果、採卵時に成熟している卵子においても、表層顆粒が細胞質表面に整列しておらず、ヒトと同様の評価ができないことが確認された。また、体外成熟卵子の観察により、表層顆粒が細胞質表面に整列しているものが多数含まれていた。体外成熟卵子が顕微授精後に発生停止になることから、カニクイザルにおいて、表層顆粒が細胞質表面に整列していることは、細胞質成熟が過剰なのではないかと推察された。

著者

鳥居 隆三 野瀬 俊明

出版者

滋賀医科大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

2010-04-01

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本研究は、移植免疫に関わる均質化した遺伝的背景、すなわち同一MHC遺伝子をもつカニクイザルとそれら個体のiPS細胞を樹立することによって霊長類を用いた実用的な移植検定系の確立を目指すことを目的とし、本年度は以下の4点の結果を得た。1)均質化MHCサルコロニーの作製:カニクイザル1,668頭についてMHC遺伝子の中で免疫拒絶に関わる主要5遺伝子の分析を試みた結果、14種のハプロタイプと30頭のホモ接合体見出し、その中のホモオス2頭から採取した精液を用いて顕微授精を試みMHCホモとヘテロ個体の作出に成功した。これによって移植免疫寛容型カニクイザルコロニーの基盤が整備出来た。2)MHCホモ個体からのiPS細胞の作製:MHCホモ個体の皮膚細胞から山中4因子をレトロウィルスベクター法によってiPS細胞の樹立に成功し、継代も順調に行う事が出来た。3)サルiPS細胞の幹細胞特性:in vitroおよびin vivoでの多能性を確認し、すでに樹立していたカニクイザルES細胞と同等の特性を持つことを確認した。さらにキメラ能確認のために蛍光タンパク遺伝子導入ips細胞を作製し、顕微授精胚(4~8細胞期胚)に注入、卵管内移植したが38日目胎子ではキメラ形成は認められなかった。ただここで用いたiPS細胞はヒト型の扁平型コロニーであったことから、キメラが見られるマウス型、即ち立体型のコローニーの作製を検討すべく培養法を改善しマウス型コロニー様とした後、GFP遺伝子導入と授精胚への注入・移植した37日目の胎子におけるキメラ能を見た結果、蛍光は観察できなかった。今後樹立の段階でマウス型コロニーを形成するiPS細胞を用いてキメラ能の確認を行いたいと考える。4)生体内移植によるiPS細胞の安全性と疾患による影響の評価:サルの健常個体に山中4因子を導入したiPS細胞をカプセル内に封入して背部皮下に移植した結果、遺伝子発現レベルの解析では、内因性KLF4、c-mycの発現亢進が認められた。この結果から将来のiPS細胞から分化誘導した細胞移植においては、とくに各種疾患をもつ患者への移植は安全性確保のための影響評価が重要であることが示唆された。なお、当初予定の5)サルiPS細胞からのin vitro配偶子形成については、キメラ能をもつマウス型コローニーのサルiPS細胞樹立後に検討する予定である。