1 0 0 0 OA G蛋白共役型受容体のホモダイマー形成によるリガンド親和性・細胞シグナルの変化に関する研究
本年度は受容体の活性化後に見られる3分子からなるトランスポートソームの形成の分子機構を、Snapinの変異体を用いて明らかにしてきました。私たちは、α_1受容体と結合したSnapinとTRPCチャネルと結合したSnapinが1:1に小胞体膜上で結合することにより、このSnapinを2分子含んだ4量体トランスポートソームが形成されるという仮説をたてました。この仮説は、昨年度の実験で相当確からしさを増してきましたが、本年も以下の実験にて下記の結果を得ました。この結果は現在論文にまとめ、投稿を準備しています(すべての結果を記載することは出来ません)。1. 変異体Snapinを用いたSnapin-Snapin複合体(ダイマー)が形成される。今年度は、Snapinの変異体を用いて、昨年度と同様にSDS-PAGEによるダイマー形成の有無、bimolecular fluorescence complementation analysis (BiFC)法を用いて、Snapin-Snapin複合体ダイマーが形成されるかどうかを明らかにしてきました。Snapin-Snapin複合体に関与するドメインについては、膜内に入っている領域である戸考えられているN末であることが明らかになり、これはSnappingが小胞体膜上で会合するのに大変都合の良い構造であることが明らかになりました。2. α_1受容体との結合に関与するSnapin蛋白のドメインの同定、ならびに、TRPCとの結合に関与するSnapin蛋白のドメインの同定上記と同様の手法を用いて、Snapinと受容体、Snapinとイオンチャネルとの結合に必要なドメインも明らかにしました。また、変異体を作成し、Snapinとこれらのタンパクが結合出来ないと、ROCが起こりにくい事などを、Fura-2を用いたRatiometryなどによって明らかにしました。
ペインティング法により100〜150μmの小孔に脂質平面膜を形成し,膜電位固定下で種々の海洋毒の作用を調べた。その結果,イワスナギンチャク毒パリトキシン,サザナミハギ毒マイトトキシン,サンゴ毒のゴニオポーラトキシンやアネモネトキシンは脂質膜に対してチャネルを形成し得なかった。しかし、海綿から得られたポリペプチドトキシンであるポリテオナミドA,B,Cの3種がチャネルを形成することを見つけた。有効濃度は1pMと低く,1MCsCl液中でのシングルチャネルの電流の大きさは+200mV負荷で約0.7pA,-200mV負荷で約2pAであった。この電位依存性はポリテオナミドA,B,Cいずれにおいても認められたが,シングルチャネル開口の持続時間はB>A>Cの順であった。3種のポリテオナミドはD体とL体のアミノ酸約40ヶが交互に結合した同一のβヘリックス構造を中央にもつことより、チャネル形成と電位依存性にこのβヘリックス構造が関係していること,しかし,チャネル開閉のゲーティングにはC末およびN末の構造の違いが微妙に影響していることが示唆された。現在,C末およびN末を化学的に修飾して,ゲーティングに対する影響を検討中である。