著者

畑中 勇輝 井上 貴美子 及川 真実 上村 悟 越後貫 成美 児玉 栄一 大川 恭行 束田 裕一 小倉 淳郎

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第108回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.OR1-28, 2015 (Released:2015-09-15)

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【目的】哺乳類のゲノム上に広く存在するレトロトランスポゾン(RT)の抑制は,個体発生や生殖細胞の分化に必須である。RTの抑制は主にDNAメチル化が担っているが,ゲノムワイドな低DNAメチル化状態にある始原生殖細胞では,抑制性ヒストンH3K9me3がその役割を担っていると言われている。そこで本研究では,同様にゲノムワイドなDNA脱メチル化が生じる着床前胚におけるRT抑制機構の解明を行った。【方法】ノックアウトまたはノックダウンにより胚発生が停止することが知られているCAF-1に着目した。CAF-1構成因子であるP150 に対するsiRNAの前核期胚への注入によりノックダウン(KD)胚を作製し,解析に供した。また,各抑制性ヒストン修飾酵素のKD胚も同様の方法で作製した。これらの胚を用いて,常法によりChIP解析,遺伝子発現解析などを実施した。【結果】既報の通り,CAF-1 KD胚は桑実期で致死となった。CAF-1 KD胚におけるマイクロアレイ解析では細胞死関連遺伝子の発現増加が認められ,DNA損傷マーカーであるH2AXのリン酸化シグナルの増加およびRT(LINE-1,SINE B2,IAP)の有意な発現上昇が観察された。RT阻害剤添加により胚盤胞期胚への発生は有意に改善出来たことから,CAF-1 KDによる胚性致死はRTの脱抑制と関連することが明らかになった。さらにChIP解析の結果,CAF-1 KD胚では,RT領域におけるH3.3からH3.1/3.2への置換が阻害され,それに伴いH3K9me2/3及びH4K20me3など複数の抑制性ヒストン修飾が減少することが示された。抑制性ヒストン修飾酵素のsiRNA注入実験により,Suv420h1/2により付加されるH4K20me3が着床前胚のRT抑制に主要な役割を果たしている可能性が示された。以上の結果から,グローバルなDNA脱メチル化される着床前胚において,CAF-1による抑制性ヒストン修飾の蓄積を介したRT抑制制御機構の存在が明らかになった。

著者

松倉 大樹 奥山 みなみ 内倉 健造 山田 未知 片桐 成二 森好 政晴

出版者

公益社団法人 日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第108回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.OR1-9, 2015 (Released:2015-09-15)

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【目的】豚の精漿には,子宮や精子の機能調節作用を持つ様々な蛋白質が含まれている。その機能を解析するためには蛋白質組成を知る必要があるが,品種や個体間でその蛋白質組成を比較した報告はほとんどない。そこで本研究では,異なる品種および個体から複数日に渡り精液を採取し,その蛋白質組成を調べた。【方法】精漿は大ヨークシャー種(以下W: n=2), ランドレース種(以下L: n=2)およびデュロック種(以下D: n=4)の3品種と交雑種(以下WLDD: n=1)の計9頭から用手法により採取した精液から分離した。9頭中4頭(W: n=1,D: n=2,WLDD: n=1)からは日をおき複数回(W: 4回,D: 3回, 4回,WLDD: 5回)にわたり精液を採取し精漿蛋白質組成を比較した。精漿蛋白質はSDS-PAGEにて分離し,各蛋白質の分子量および全精漿蛋白質に対する百分比を算出した。【結果】5-180kDaの範囲内では最大19本の分子量の異なるバンドが検出され,組成の約20%を180kDa以上の高分子量蛋白質が占め,約60%を19kDa以下の低分子量蛋白質群が占めていた。19本のうち全個体に共通して見られたバンドは6本であった。その推定される分子量,組成比および組成比のCV値は119.2–122.9kDa,2.3±1.0%, 43%; 96.8–101.4kDa,1.3±0.56%, 43%; 73.3–77.3kDa, 5.8±1.6%, 27%; 61.6–65.3kDa, 7.8±2.3%, 30%; 10.4–11.8kDa,34.7±4.0%, 11.6%; 8.2–9.7kDa, 18.9±3.3%, 17.3%であり(平均±SD),その組成比は個体間でばらつきがあることがわかった。残りの13バンドはその有無が品種で共通のものではなく個体による差が認められた(1–3個体に共通:5本,4–6個体に共通:4本,7–8個体に共通:4本)。採精日間においては,CV値が50%以上のバンドが,Dの1個体で1本(34.0–37.0kDa),Wで1本(61.6–65.3kDa),WLDDで1本(34.0–37.0kDa)あり,CV値はそれぞれ,53%,51%, 56%となった。以上より,個体および採精日によって精漿蛋白質組成比に違いが認められたため,今後はさらに個体数および採精回数を増やして検討する予定である。

著者

中田 久美子 小野 千紘 吉田 薫 吉田 雅人 吉田 学 山下 直樹

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第108回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.OR1-11, 2015 (Released:2015-09-15)

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【目的】現在,テオフィリン等の薬剤がヒト不動精子の運動性回復に使用されているが,顕微授精の際に刺入精子とともに卵子細胞内への薬剤が混入することが危惧されている。一方,水素分子は細胞毒性の高い活性酸素種を選択的に還元する作用を有し,副作用が極めて少ないことが知られている。本研究は,解糖系と電子伝達系によるATP産生の阻害剤を用いて,ヒト精子の運動性に対する水素分子の作用機序を明らかにすることを目的とした。 【方法】インフォームドコンセントの得られた,治療後廃棄予定の精子(n=26)を用いた。本実験では85%以上の運動性を有する正常精子を材料とした。その精子をTYB(Test-Yolk-Buffer,JX日鉱日石エネルギー)にて凍結,融解を2回繰り返し,2回目の融解後の洗浄にはグルコース非添加のTYH(G-N区)を使用し,100μlに調整した後,室温に静置した。24時間後,再度遠心処置を行い,ペレットを3等分にし,50μlのグルコース添加のTYH(G+N区),水素分子含有のグルコース非添加のTYH(G-H区)とG-N区にそれぞれ混和した。また,一部のG-N区およびG-H区に40μMのアンチマイシンAを添加した(G-N-A区,G-H-A区)。各過程で,マクラーチャンバーおよびSCAにて運動率および運動性を測定した。 【結果】G-N,G+N,G-H区の運動率はそれぞれ,2.2%,9.7%,8.3%であり,G+N,G-H区はG-N区よりも有意に高かった(P<0.01)。G-N-A区の運動率は0.07%であるのに対し,G-H-A区は1.8%であり,有意に高かった(P<0.05)。 【考察】グルコース非添加かつ電子伝達系阻害剤の存在下で水素分子は,ヒト精子の運動性を有意に改善させた。これらの結果は,水素分子は精子ミトコンドリアの電子伝達系のATP産生を促進する効果があることが示唆している。

著者

大塚 正人 GURUMURTHY Channabasavaiah 三浦 浩美 佐藤 正宏 和田 健太 高橋 剛

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第108回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.P-83, 2015 (Released:2015-09-15)

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【目的】近年,CRISPR/Cas9系を含めたゲノム編集技術の開発によって,簡便にノックアウト(KO)マウス等のゲノム編集マウスを作出できるようになってきた。現行法では,(1)過排卵処理を施した雌マウスを雄マウスと交配して受精卵を採取する,(2)CRISPR関連核酸を受精卵へ直接顕微注入する,(3)顕微注入処理した胚を偽妊娠マウスの卵管へ移植する,という3つのステップを経て作製する方法が一般的である。しかしながら,これらは熟練した技術とmicromanipulatorという高価な設備を必要とするため,誰もが容易に実施できる環境にある訳ではない。そこで我々は,採卵,顕微注入,移植の手間を省くことが可能な,新規ゲノム編集マウス作製法「Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery (GONAD)法」を考案した。【方法】麻酔処置を施された妊娠雌マウスから2細胞期受精卵を有する卵管を体外に露出させ,ガラスピペットを用いてCRISPR関連核酸溶液を卵管内に注入し,その後,直ちに卵管全体に対し電気穿孔法を施す。術後,卵管を雌マウスの体内に戻し,そのまま発生させる。【結果】本手法の妥当性を確認するために,まず,本技術によってRNA導入が可能であるかを検証した。GONAD法を用いてeGFP mRNAの導入を試みたところ,卵管上皮細胞および着床前胚でのeGFPの発現が観察された。そこで,次にCRISPR関連RNA(Cas9 mRNAとsgRNA)の導入を試みた。その結果,着床前胚において複数の内在性遺伝子,およびeGFP遺伝子のKOに成功した。また,着床後胚においてもeGFP遺伝子のKOにも成功した。これらの結果から,卵管内の受精卵に核酸を直接導入することにより,採卵や顕微注入,移植という一連の高度であるが,煩雑な工程を全てスキップしてゲノム編集マウスを簡便に作製できることが示された。

著者

白砂 孔明 島村 成美 妹尾 琴実 大津 彩華 白築 章吾 大口 昭英 岩田 尚孝 桑山 岳人

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第108回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.OR2-19, 2015 (Released:2015-09-15)

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【目的】胎盤は妊娠に必須の器官である。ヒトでは胎盤形成時に栄養膜細胞の浸潤および子宮らせん動脈の置換が起き,胎盤内が生理的な低酸素環境(酸素濃度5−8%)になる。しかし,重度の低酸素環境(1−2%酸素濃度)に陥ると胎盤から抗血管新生因子(sFlt-1,sEng)や炎症性サイトカインが産生され,妊娠高血圧腎症につながると考えられている。酸素濃度が胎盤機能に影響すると考えられるが,胎盤細胞を用いた多くの研究は通常酸素下(21%)で実施されている。本研究では,軽度な低酸素環境で胎盤細胞を培養した場合,通常酸素環境下とは異なる応答性を示すと考え検証した。 【方法と結果】 ①ヒト栄養膜細胞株Sw71を5%および21%酸素濃度で培養し,炎症性サイトカイン・インターロイキン6(IL-6),sFlt-1およびsEng,細胞増殖率を測定した。5%酸素でSw71細胞を培養すると,21%酸素下と比較してIL-6,sFlt-1およびsEng濃度が低下し,細胞生存活性が増加した。②炎症応答性を検証するためにリポポリサッカライド(LPS)を添加した。両酸素濃度下でLPSはIL-6分泌を刺激したが,LPS誘導性IL-6濃度は5%酸素下において21%酸素下よりも低かった。また,Toll-like receptor 4(TLR4:LPS受容体)発現は5%酸素下で低下した。③低酸素で炎症応答性が変化したため,低酸素誘導因子HIF1αを検討した。21%酸素下ではHIF1αはほとんど発現しなかったが,5%酸素下ではHIF1α発現が増加した。HIF1誘導剤である塩化コバルトを添加すると,TLR4発現が低下するとともに,LPS誘導性IL-6分泌も低下した。また,HIF1抑制剤であるPX-12を添加すると,酸素濃度に関わらずIL-6分泌が増加した。 以上から,軽度な低酸素環境で栄養膜細胞株を培養すると,sFlt-1およびsEngの分泌や炎症応答が低下した。また,5%酸素下ではHIF1が作用することで炎症応答を抑制的に制御することが分かった。