5 0 0 0 300年経過の資料を用いた伊達家三藩主のDNA解析
ヒトY染色体上のDNAマーカーであるY-STRs (short tandem repeat)やY-SNPs (一塩基多型:single nucleotide polymorphisms)は、法医学で、同胞鑑定や性的事件などにおける男性由来の型を検出する目的として利用されつつある。アメリカ合衆国NISTが開発した10ローカス(DYS436、DYS439、DYS435、DYS19、DYS460、Y GATA H4、DYS391、DYS392、DYS438、DYS437)のY-STRをマルチプレックス法により型判定できるシステム(10-plex)及び市販のY-PLEX6キット(DYS393、DYS19、DYS389、DYS390、DYS391、DYS385)を用いて、日本人(名古屋207名、沖縄87名)及びタイ人(117名)について、共通な2ローカスを除く14ローカスのハプロタイプ解析を行った。また、非常に情報量が少ないDYS436をMinimal Databaseに含まれるDYS389Iに入れ換え、改良型の10-plexシステムを作製した。この改良型10-Plexによる14ローカスを用いて、父子関係が証明されている日本人の161組の父子DNA試料から型判定したところ、5例の突然変異が観察された。その内訳は、DYS389I、DYS439、Y-GATA-H4及びDYS389IIローカスで、1リピートの増加、DYS391ローカスで、1リピートの減少であった。このY-STR全体の突然変異率は、0.22%/ローカス/減数分裂(95%信頼区間0.09-0.51%)で、ヨーロッパ人とほぼ同じ値であることが示唆された。本研究での目的の一つである日本人におけるY染色体上のDNAマーカーの突然変異率を算定することは達成できた。
1 0 0 0 OA 常染色体STRマーカーを用いた日本国内及びその周辺のヒト集団の同定法の確立
日本国内の地域集団及び日本周辺諸国の地域集団から採取されたDNA試料について、多数のほぼ均等に常染色上分布する4塩基リピートのSTRs(short tandem repeats)マーカーが型判定された。そのうち、105座位のSTRsが、日本人5地域(秋田・名古屋・大分・沖縄)、中国人(漢民族) 5地域(北京・陝西・湖南・福建・広東)、タイ人(バンコク)、ミャンマー人(ヤンゴン)、モンゴル人2地域(オラーゴン・ダランザドガド)、韓国人(ソウル)及び中国人(朝鮮族)(瀋陽)のDNA試料が型判定され、系統遺伝学的、構造遺伝学的、3次元的分布などの集団遺伝学的解析が行われた。その結果、日本人と中国人とが統計学的に区別できる可能性が示唆された。そこで、各座位のアレルごとの中国人に対する日本人らしさの割合を算出し、その割合を各個人ごとに積算した分布を正規分布に補正したところ、ある程度日本人と中国人とを確率的に区別できる方法が確立できた。また、同様に250以上のSTRs座位を型判定できるマルチプレックスシステムを構築した。このシステムを利用することにより、日本人と韓国人、あるいは日本人国内の地域差を調べることができる可能性が考えられた。
近年のPCR法の開発により、毛髪からのDNAを利用した各種遺伝マーカーの判定が可能となり、私はこれまでにHLAクラスII遺伝子型の判定を毛髪に応用し、抜去毛の毛根部からの型判定、及び毛髪中のメラニンによるPCR反応の阻害を報告した。HLAクラスII遺伝子は多型性に富んだ遺伝マーカーであり、毛髪特に毛幹部に応用できるならば、毛髪資料が個人識別に大きく寄与することは確実である。しかしながら、毛幹部に含まれるDNAは微量であるため、本研究では、効率的なDNAの抽出法の検討や、高感度PCR法の応用を行なった。毛髪特に毛幹部に含まれるDNA量は極めて微量であり、さらに抽出段階で混入するメラニンによるPCR反応の阻害が無視できないことから、充分量かつ高純度のDNAを効率よく回収する抽出法の検討を行なったところ、フィルター付遠心チューブを用いることにより、従来のフェノール抽出法に比べメラニンをかなり除去することができた。この方法は短時間にかつ簡便に行なうことができるので、有効な抽出精製法と考えられる。こうして抽出したDNAから、HLA-DQA1遺伝子の第二エクソン部分をPCR法により選択的に増幅した。毛幹部より抽出したDNAは微量であるため、通常のPCR法よりも格段に増幅感度の高いsemi-nested PCR法を採用したところ、毛幹部から充分量の増幅産物が得られ、型判定も可能となった。このPCR法は他のHLAクラスII遺伝子にも応用が可能であり、他の法医資料や考古学的資料からのDNAタイピングに有用である。