著者

高橋 政代 春田 雅俊 田邊 晶代 柏井 聡

出版者

京都大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

2001

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現在、社会的に問題となっている中途失明者の原因の多くは網膜の視細胞が選択的に障害されることによる。これらの網膜疾患に対して胎児網膜組織を移植することが欧米では試みられているが、胎児組織を利用することの倫理的問題、ドナー不足の問題、拒絶反応など問題も多い。我々は網膜幹細胞を培養して、視細胞移植の細胞源として臨床応用できないかを検討している。今回、胎児網膜、成体虹彩、成体毛様体から網膜幹細胞を分離培養しうるか、またこれらの細胞が視細胞への分化能を有しているかを確認した。ラットの胎児網膜をneurosphere法で培養することにより、神経前駆細胞のマーカーであるネスチンを発現する網膜前駆細胞を培養することができた。これらの網膜前駆細胞は分化誘導条件下では効率よく視細胞にも分化する。しかし継代を重ねるとともに視細胞に分化する割合も減少し、網膜としての組織特異性が失われてしまうことが分かった。次に毛様体色素上皮や虹彩上皮から網膜幹細胞を培養できないかを試みた。成体ラットの毛様体色素上皮や虹彩上皮からは細胞分裂して増殖し、神経前駆細胞のマーカーであるネスチンを発現する神経前駆細胞を得ることができた。これらの細胞は分化誘導条件下で引き続き培養するとニューロンまたはグリアのマーカーを発現するが、視細胞に特異的なマーカーは発現しなかった。そこで視細胞の発生に必要不可欠なCrxホメオボックス遺伝子を導入すると、成体の毛様体組織や虹彩組織から視細胞に特異的なマーカーであるロドプシンやリカバリンを発現する細胞を得ることができた。毛様体組織と異なり、虹彩組織は臨床的に確立された周辺虹彩切除術で安全確実に自己組織を採取できる。そのため、今回虹彩組織から得られた視細胞が生体内でも機能することが確認できれば、将来拒絶反応のない視細胞移植として、臨床応用することも期待できる。

著者

高橋 政代 万代 道子 本田 孔士 谷原 秀信

出版者

京都大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

1997

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本研究の目的:増殖性硝子体網膜症の発症に網膜色素上皮細胞の増殖、遊走の関与が考えられる。今回我々は細胞の動態と各種転写因子の関与を解明し、増殖性硝子体網膜症の新しい治療法をを開発することを目指した。方法:各種転写因子中、E2F転写因子、NFκB転写因子に注目した。デコイ法を用いて、網膜色素上皮細胞の増殖、遊走を解明し、E2F転写因子、NFκB転写因子の機能的意義を解明する。動物実験で転写因子の抑制で増殖性硝子体網膜症が可能か検討した。結果:E2F転写因子:(1)増殖期培養網膜色素上皮細胞の核抽出液中に、E2Fコンセンサス領域を含む、二重鎖オリゴヌクレオチドと結合する因子の存在を確認した。(2)増殖期培養細胞でE2Fデコイは細胞周期調節因子の発現を抑制するが、非特異的デコイでは影響を与えないことをRT-PCR法で確認した。(3)細胞増殖能をbrdU labellingindex、DNA合成量で判定した。E2Fデコイの導入では効果的に濃度依存的に抑制されるが、非特異的デコイの導入では影響が無いことを確認した。NFκB転写因子;(1)培養網膜色素上皮細胞の核抽出液中に、NFκBデコイと結合する因子が誘導されることを確認した。(2)IL-1β刺激によって培養網膜色素上皮細胞中で、IL-1βの転写がさらに増加するが、NFκBデコイの導入でその発現が効果的に抑制されるが、非特異的デコイの導入では影響が無いことをRT-PCR法で確認した。(3)培養細胞創傷治癒モデルにNFkBデコイを導入すると、培養網膜色素上皮細胞の遊走が非特異的デコイの導入に比べて有意に抑制されることを確認した。(4)NFκBデコイを培養ヒト線維芽細胞に導入し、白色家兎増殖性硝子体網膜症モデル眼硝子体内へ注入した。Bluemenkrazらによる分類でPVRを判定したがNFkBデコイ、非特異的デコイで有意差を認めなかった。各実験眼で結果の偏差が大きく動物眼での有効性をさらに検討する必要があると考えた。

著者

高橋 政代 柏井 聡 田辺 晶代

出版者

京都大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

1999

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毛様体色素上皮細胞の培養と神経分化誘導成体ラット毛様体組織を分離して色素上皮細胞側が下面になるようにして培養皿に接着させた。塩基性線維芽細胞増殖因子を加えた無血清培地を用いた培養により、毛様体組織から増殖して培養皿上に遊走する細胞が得られた。これらの細胞は多くが神経幹細胞のマーカーであるネスチンを発現するようになった。毛様体色素上皮から増殖した細胞を引き続き神経分化誘導条件(血清添加)下で培養すると上皮様形態であった色素上皮細胞は劇的に形態を変化させ、一部には神経様突起をもった細胞も認められた。これらの細胞の一部はニューロンのマーカーであるNeurofilament 200およびグリアのマーカーであるGlial Fibrilary Acidic Proteinを発現していた。ただしこの培養条件下では視細胞のマーカーであるオプシンの発現は得られなかった。アデノウイルスを用いたCrxとGFPの遺伝子導入次に視細胞に特異的に発現するホメオボックス遺伝子であるCrxを導入することにより、毛様体の色素上皮細胞が視細胞に分化しうるかについて検討した。毛様体色素上皮細胞に対し、視細胞特異的ホメオボックス遺伝子であるCrxまたはレポーター遺伝子であるGFP(Green Fluorescein Protein)を組み込んだアデノウイルスを感染させた。引き続き神経分化誘導条件下で培養したのち免疫細胞化学的解析を行った。GFPを導入した毛様体色素上皮細胞からは視細胞のマーカーであるオプシン陽性細胞は得られなかったのに対し、Crxを導入した細胞ではオプシンを発現する細胞が多数認められた。これらの結果から成体ラット毛様体色素上皮から未分化な神経幹細胞あるいは神経前駆細胞が得られ、Crxを遺伝子導入することにより、毛様体色素上皮細胞は視細胞に分化転換する可能性があることが示された。

著者

高橋 政代

出版者

京都大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

1998

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アメリカへ渡航しGage研究室を訪問したことによって、神経系幹細胞の培養方法を習得し、また最適な網膜移植法の検討を行った。Gageが確立した海馬由来神経系幹細胞(LacZ遺伝子でマーキング済み)を、生後5日以内の幼若ラット網膜に移植すると、2週間では移植細胞は網膜表面に付着するのみであるが、移植後4週間では移植細胞は多数網膜内に侵入、分化した。移植細胞の形態は、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞に酷似し、しかもそれぞれの細胞に適した層に生着していた。このような現象はコントロールとして使用した線維芽細胞や死滅させた幹細胞などではおこらなかった。生着した神経系幹細胞を様々な網膜細胞特異抗体で免疫染色を行ったところ、移植した細胞の中にはGFAPおよびS-100β、Map2,5などグリアあるいは神経のマーカーは陽性のものがあったが、HPC-1、opsinなど網膜神経に特異的な蛋白は陰性であった。このことは移植した未分化な神経系幹細胞は環境因子に反応し神経やグリアに分化するが、網膜細胞へと完全に分化するためには、さらになんらかの内因的あるいは外因的因子を要することを意味する。以上の結果を受けて、今後の研究の方向性を検討し、不足している内因的因子としてRxなどのhomeobox遺伝子をアデノウイルスをもちいて導入し、網膜細胞への分化を促すことを計画しており、そのためのRx,Crx,Chx10のhomeobox遺伝子を入手した。また、今回は海馬由来の神経系幹細胞を用いたが、網膜から神経系幹細胞を培養することにより、網膜細胞へ分化しやすい幹細胞を得ることも計画している。

著者

高橋 政代 谷原 秀信 GAGE Fred H 本田 孔士 FRED H. Gage GAGE Fred H. 竹市 雅俊 高橋 政代

出版者

京都大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

1998

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成体ラットの網膜を機械的に損傷し、直後にLacZでラベルされた成体ラット海馬由来神経系幹細胞の懸濁液を硝子体中に注入した。1,2,4週後に4%paraformaldehydeにて灌流固定し、凍結切片を作製、ニューロン・グリア系の各種マーカーおよび抗β-galactosidase抗体を用いて蛍光抗体法による光学顕微鏡的観察および金粒子銀増感法による電子顕微鏡的観察を行った。移植された神経系幹細胞は損傷部周囲のホスト網膜の表層から内顆粒層に多く分布していた。移植細胞は移植後1週で神経前駆細胞のマーカーであるnestinを多く発現していた。移植後4週では、移植細胞におけるnestinの発現は減少し、神経細胞のマーカーであるMAP2abやMAP5、グリア細抱のマーカーであるGFAPを発現するものがみられた。網膜神経細胞のマーカーであるHPC-1,calbindin,rhodopsinの発現はほとんどみられなかった。電子顕微鏡的には、移植細胞の一部は仮足または細胞突起により移植細胞同士、あるいは移植細胞とホスト細胞間で接触していることが観察された.内網状層のレベルにおいては、移植細胞とホスト細胞との間でシナプス様構造を形成していることが観察された。損傷網膜に移植された神経系幹細胞は、ニューロンおよびグリアに分化することが示されたが、網膜特異的な神経細胞への分化はみられなかった。しかし電子顕微鏡的には、移植細胞はホスト網膜への親和性を持つ細胞に分化することが示され、またホスト網膜とのシナプス様構造の形成は、物理的接触のみならず機能的にも連絡している可能性があると考えられた。

著者

高橋 政代

出版者

日本表面科学会

雑誌

表面科学 : hyomen kagaku = Journal of the Surface Science Society of Japan (ISSN:03885321)

巻号頁・発行日

vol.30, no.4, pp.190-192, 2009-04-10

著者

高橋 政代 JIN Zi-Bing

出版者

独立行政法人理化学研究所

雑誌

特別研究員奨励費

巻号頁・発行日

2007

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網膜色素変性(RP)は網膜視細胞の機能が障害される遺伝性の疾患群であり、遺伝性失明、また、60歳以下視覚障害者の最大の原因である。原因となる遺伝子変異は多数解明されているものの遺伝子診断を一般的な臨床検査とするまでにはまだまだ多くの課題が残っている。まず、全身疾患を伴わないRPについてこれまでに原因遺伝子が判明しているのは少なくとも40個と多数ある。RP患者の半分以上は弧発や遺伝形式不明であり、遺伝子診断や遺伝カウンセリングはほぼできないのが現状であり、多数の患者が遺伝子診断及び遺伝カウンセリングを受けられないのである。そこで、我々は効率とコストの面を考えながらdHPLCを用いた方法で遺伝形式を問わず全てのRP患者における網羅的な変異解析を試みた。約15%の弧発例や遺伝形式不明の患者で原因と思われる遺伝子変異を検出。結果はその内、18個が新規変異であった(Journal of Medical Genetics,2008)。効果的な治療法が現れない現状では、世界の研究者はES細胞やiPS細胞からin vitro分化してきた視細胞あるいは前駆細胞などを網膜細胞移植の重要なソースと期待しており、我々は世界初マウス、サル及びヒトES細胞から網膜視細胞への分化を効率よくできた(小坂田、高橋らNat Biotech 2008)。この成果により、視細胞分化誘導法及び移植細胞源に関する問題を解決できた。しかし、胚性幹細胞の生命倫理学的な配慮と移植における免疫拒否などの問題は残っている。そこで最近、皮膚などの組織体細胞から再生医療の大きな武器である「多能性幹細胞」を人工的に作ることに成功した(山中)。我々はこのips細胞を用いて視細胞の前駆細胞及び視細胞への分化に取り組み、ヒトips細胞から視細胞の分化に成功した(Hirami et al.,unpublished)。更に小分子を用いて新たな分化方法を効率よくできた(OsaRada F,Jin ZB et al.,unpublished)。これらの研究結果から、網膜色素変性症患者に対して遺伝子診断の臨床応用をでき、また、網膜再生の移植ソースとして視細胞分化を効率よくできた。

著者

万代 道子 秋元 正行 高橋 政代 小杉 眞司

出版者

独立行政法人理化学研究所

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

2005

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網膜色素変性の病態理解を深めるために、遺伝学的、免疫学的、各種臨床検査の結果などのデータを蓄積することにより、多面的な病態解析を試みた。まず、変性HPLCに基づくスクリーニング及び直接シークエンスによる確認を行うことにより、労力、経費を効率化して30に及ぶ原因候補遺伝子を網羅的に調べる遺伝子診断システムを確立した。この方法を用いて、典型的な色素変性患者250名を対象に遺伝子診断を行い、これまでに30症例において、疾患原因候補の遺伝子変異を検出した。これは、遺伝形式には無関係に遺伝子診断を行ったが、原因遺伝子の検出頻度が最も高いとさえる優性遺伝に限定した報告とほぼ同頻度の良好な検出率であった。また、検出された遺伝子のプロファイルもこれまでのわが国における報告と相同性が高く、スクリーニングとしての機能は十分果たしていると思われた。また、免疫学的アプローチとして網膜色素変性類縁疾患である自己免疫網膜症の原因の一つともされるリカバリン血清抗体価を加齢黄斑変患者を対照群として調べたところ、網膜色素変性患者において抗体価の上昇がみられた。特に抗体価の高い症例においては眼底所見に比べ強度の視野狭窄の進行や一時的に急激な悪化時期の存在など、二次的な自己免疫機序が網膜色素変性の進行をさらに修飾している可能性が示唆された。さらに臨床画像診断の多面的解析において、色素変性患者では、健常な色素上皮細胞の存在を示唆する自発蛍光を有する領域が、高解像度網膜光干渉断層像(OCT)で観察される健常な視細胞領域と一致するものと一致しないものとが観察され、前者では色素上皮と視細胞の変性がほぼ同時進行していると考えられるのに対し、後者においては視細胞の変性が先行し、変性の激しい領域で色素上皮からの自発蛍光が高輝度となっている可能性が考えられた。これらは色素変性において相互依存的である「視細胞-色素上皮」コンプレックスとしての変性過程が一様でないことを示唆していると思われた。