著者

山下 まり 此木 敬一 稲垣 英利 森 直樹 森 哲

出版者

公益社団法人 日本農芸化学会

雑誌

化学と生物 (ISSN:0453073X)

巻号頁・発行日

vol.58, no.2, pp.111-119, 2020-02-01 (Released:2021-02-01)

参考文献数

46

被引用文献数

1 1

著者

工藤 雄大 千葉 親文 長 由扶子 此木 敬一 山下 まり

出版者

天然有機化合物討論会実行委員会

雑誌

天然有機化合物討論会講演要旨集 57 (ISSN:24331856)

巻号頁・発行日

pp.PosterP63, 2015 (Released:2018-10-01)

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[背景・目的] テトロドトキシン (tetrodotoxin, TTX, 1) は、電位依存性ナトリウムチャネルを強力かつ選択的に阻害する神経毒であり、致死性の食中毒を引き起こす。TTXはフグ、巻貝、カニなどの海洋生物、および陸棲の両生類であるイモリやカエルに含まれ、世界中に分布する。この特異な構造が自然界でどのように構築されるかは予測が困難であり、TTXの生合成経路は未だ解明されていない。既に我々も含めた複数の研究グループが海洋由来のバクテリアによるTTXの生産を報告しており1)、TTXは食物連鎖により海洋生物へと蓄積されると考えている。一方、陸上におけるTTXの生産生物は未同定である。唯一のラベル化合物の投与実験として、清水らによるイモリへのarginine, acetate等の投与例があるがTTXはラベル化されず2)、遺伝子解析からTTXの生合成経路に言及した研究もこれまでない。そこで我々は、TTX類縁体の化学構造が生合成経路を反映していると考え、新規TTX類縁体(生合成中間体)を得るために質量分析器を駆使した網羅的な探索を実施してきた3)。そして最近、有毒のオキナワシリケンイモリ (Cynops ensicauda popei) から、TTXのC5-C10が直接炭素-炭素結合した10-hemiketal-typeの類縁体の4,9-anhydro-10-hemiketal-5-deoxyTTX (2) を発見した。化合物2は国内外の複数の有毒イモリに共通して存在していたため生合成中間体であると考え、2の特徴的な骨格構造からモノテルペンを出発物とする新たな生合成経路の可能性を考えた (Fig. 1)4)。本研究では、推定した経路を基に更なる生合成中間体を探索したので報告する。また未解明であるイモリにおけるTTXの起源を追及した。Figure 1. Proposed biosynthetic pathway towards TTX based on the structure of 2.4) 1. 新規環状グアニジン化合物群とTTX生合成経路の考察 質量分析器を用いて推定した生合成経路における中間体を探索した。これまで我々は水溶性の高いTTX類縁体の探索法として、希酢酸加熱抽出、活性炭による前処理、HILIC-LC-MS/MS3c, 5)による解析を行ってきた。しかし、本研究のターゲットとなる生合成中間体はTTX類縁体よりも親水性が低いことが予想されたので、探索のステップをそれぞれメタノール抽出、ODSによる前処理、逆相カラムによるLC-MSへと変更し、より初期の生合成中間体に焦点を当てた探索法を新たに構築した。この疎水性化合物用の探索法と従来の親水性化合物用の探索法の二つの方法で予想生合成中間体の発見を目指した。1-1. Cep-210, Cep-212の構造解析疎水性化合物の探索では、C. e. popeiのメタノール抽出物から[M+H]+ m/z 210.1606 (C11H20N3O, err. 2.2 ppm, ESI-TOF-MS) の微量新規成分 (Cep-210, 3) を検出した。その分子式から、化合物3は予想生合成中間体に相当する可能性が考えられたため、大量抽出および単離・構造決定を試みた。化合物3をC. e. popeiの身体組織 (415 g、約70匹) からメタノールで抽出して分配操作を行った後、数種の逆相カラムと弱酸性陽イオン交換カラムを用いて単離した。得られた3(69 nmol、マレイン酸を内部標準として1H NMRの積分値より算出)をCD(View PDFfor the rest of the abstract.)

著者

丸田 聡 山岡 薫 大越 夏実 山下 まり

出版者

天然有機化合物討論会

雑誌

天然有機化合物討論会講演要旨集

巻号頁・発行日

no.49, pp.443-448, 2007-08-24

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Tetrodotoxin (TTX) and saxitoxin (STX) bind to a single site in the outer pore of the voltage-gated sodium channels (Na_vs), formed by the amino-acid residues in the outer-pore loops (p-loops) located between the S5 and S6 segments of each of the homologous domain (I-IV) of the a-subunit. Since puffer fish and newts accumulate TTX at high concentration in their tissues, they are thought to have special defense systems against their own TTX. We previously obtained a cDNA encoding Na_v from Fugu pardalis skeletal muscle (fMNa1=fNav1.4a). In fNav1.4a protein, the aromatic amino acid in p-loop region of Domain I in TTX-sensitive Nays was replaced by Asn. Also, Kaneko et al. reported that similar mutation was found in Na_v of retinal neuron of the newt, Cynops pyrrhogaster. In this study, we confirmed that these mutations are responsible to TTX-resistance of puffer fish and newts by evaluation of IC_<50>-TTX values of the corresponding mutants of rNav1.2a transiently expressed in HEK293 cells by electrophysiological study.

著者

秋元 隆史 篠原 涼子 岩本 理 山下 まり 山岡 薫 長澤 和夫

出版者

天然有機化合物討論会実行委員会

雑誌

天然有機化合物討論会講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.53, pp.517-522, 2011

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Voltage-gated sodium channels (Na_vCh) are transmembrane proteins that provide inward current carried by sodium ions, and they contribute to the control of membrane excitability, as well as the propagation of action potentials along axons. To date, nine subtypes of sodium channels (NaChs) have been identified, which are closely related to life activity such as a sense of pain, a heartbeat, the muscle expansion and contraction. Since each of these subtypes has unique properties, subtype selective ligand is required for controlling and elucidation of these functions. Saxitoxin (STX) is a naturally occurring NavCh inhibitor, which is believed to bind to the P-loop region of the ion-selective filter in NavCh, and blocks ion influx of Na_vChs in a similar manner to tetrdotoxin (TTX). Recently, a binding model of STX with P-loop domain was proposed based on molecular docking studies by Zhorov. From this model, domain I and STX in C13 and N7 is crucial for the interaction. In this paper, we described the structure-activity relationship studies on STX derivatives with focusing on the C13 and N7 positions. New STX derivatives of 14, 16-18, 23 and 24 modified at C13 and N7 were synthesized from fully protected form of STX of 8 efficiently. Inhibitory activity of these new derivatives against Na_vChs, i.e., Na_v1.2, Na_v1.4 (these are TTX-sensitive) and Na_v1.5 (TTX-resistant), were evaluated by the who'e-cell patch clamp method. As shown in Table 1, these derivatives show moderate inhibitory activities against Na_v1.2, Na_v1.4, but no inhibitory activity was observed to Na_v1.5. Further SAR studies are in progress.

著者

岩本 理 篠原 涼子 此木 敬一 山下 まり 長澤 和夫

出版者

天然有機化合物討論会

雑誌

天然有機化合物討論会講演要旨集

巻号頁・発行日

no.51, pp.181-186, 2009-09-01

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Saxitoxin (STX) (2) and its analogues known as causative agents of paralytic shellfish poisoning, so called PSP, are potent neurotoxins produced by harmful dinoflagellates. This fatal intoxication is attributed to STXs' potent affinity against the voltage gated sodium channels (NaChs), thus the toxins strongly block the influx of sodium ion and inhibit the depolarization process of neuronal cells. We have recently accomplished total synthesis of (-) and (+)-doSTX (ent-2 and 2) and (+)-STX (1) by the use of 1,3-dipolar cycloaddition reaction and unique IBX oxidation reaction. In this paper, we described the NaCh inhibitory activity of novel synthetic STX derivatives 19-22. We also succeeded in developing the new synthetic methodology for constructing the cyclic guanidine skeleton under the extremely mild conditions, which successfully allow us to the total synthesis of (+)-dcSTX (3) and (+)-GTX3 (7) from "protected" saxitoxinol 34.

著者

丸田 聡 山岡 薫 大越 夏実 山下 まり

出版者

天然有機化合物討論会実行委員会

雑誌

天然有機化合物討論会講演要旨集 49 (ISSN:24331856)

巻号頁・発行日

pp.443-448, 2007-08-24 (Released:2017-08-18)

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Tetrodotoxin (TTX) and saxitoxin (STX) bind to a single site in the outer pore of the voltage-gated sodium channels (Na_vs), formed by the amino-acid residues in the outer-pore loops (p-loops) located between the S5 and S6 segments of each of the homologous domain (I-IV) of the a-subunit. Since puffer fish and newts accumulate TTX at high concentration in their tissues, they are thought to have special defense systems against their own TTX. We previously obtained a cDNA encoding Na_v from Fugu pardalis skeletal muscle (fMNa1=fNav1.4a). In fNav1.4a protein, the aromatic amino acid in p-loop region of Domain I in TTX-sensitive Nays was replaced by Asn. Also, Kaneko et al. reported that similar mutation was found in Na_v of retinal neuron of the newt, Cynops pyrrhogaster. In this study, we confirmed that these mutations are responsible to TTX-resistance of puffer fish and newts by evaluation of IC_<50>-TTX values of the corresponding mutants of rNav1.2a transiently expressed in HEK293 cells by electrophysiological study.

著者

工藤 雄大 山下 瑶子 此木 敬一 長 由扶子 安元 健 山下 まり

出版者

天然有機化合物討論会実行委員会

雑誌

天然有機化合物討論会講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.55, 2013

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<p>テトロドトキシン (TTX, 1)は電位依存性ナトリウムチャネルを特異的に阻害する強力な神経毒である。TTXはフグから単離されたが、その後、カニや巻貝、ヒョウモンダコ、ヒラムシなどの多様な海洋生物、更には陸棲のイモリ、カエルからも同定された。高度に架橋した構造と強力な生理活性、広範な生物種に分布する特徴から、極めて興味深い化合物である。TTX生産細菌を報告し ¹⁾、その後も数多くの報告があるが、TTXの生合成に関わる出発物質、遺伝子は未だに同定できていない。我々はTTX天然類縁体が生合成経路解明の手がかりになると考え、フグやイモリから種々のTTX類縁体を単離・構造決定してきた ^2-4)。今回HILIC (Hydrophilic interaction liquid chromatography: 親水性相互作用) -LC-MSを用い ⁵⁾、新規TTX類縁体を探索したところ、オキナワシリケンイモリ (Cynops ensicauda popei) 及びヒガンフグ (Takifugu pardalis)から新規TTX類縁体と推測される化合物が数種検出され、これらの単離・構造決定を行った。さらに、各種TTX含有生物における分布を調査し、TTXの生合成経路の推定を試みた。</p><p>1. イモリから得られた新規TTX類縁体の構造と分布</p><p>TTXの生合成中間体は生理活性を持たない可能性が高く、生理活性を指標としたスクリーニングは適切ではなかった。そこで、TTX類縁体の一斉分析が可能なHILIC-LC-MSを用い、既知のTTX類縁体のフラグメントイオンを指標として新規TTX類縁体を探索した。C. e. popeiを希酢酸加熱抽出し、活性炭カラムで粗精製した後、HILIC-LC-MSに供し、新規TTX類縁体を探索した。2種の新規TTX類縁体 (2, 3) (Fig. 1)が検出されたため、これらを弱酸性陽イオン交換カラムBio-Rex70 (Bio-Rad)、HITACHI GEL #3011-C、HITACHI GEL #3013-Cを用いて精製した。3は更なる精製が必要であったため、TSK-gel Amide-80 (Tosoh)を用いて精製した。2はC. e. popeiの全組織170 gから約250 μg得られた。3は内臓組織を除いた身体組織65 gから約300 μg、4,9-anhydroTTXとの混合物 (約1:1)として得られ、そのまま解析に用いた。2, 3の分子式はそれぞれESI-Q-TOF-MSを用いてC₁₁H₁₅N₃O₄及びC₁₁H₁₅N₃O₆と決定した。2: [M+H]⁺ m/z254.1136 (calcd. for C₁₁H₁₆N₃O₄254.1135, error: 0.4 ppm), 3: [M+H]⁺ m/z 286.1036 (calcd. for C₁₁H₁₆N₃O₆286.1034, error: 0.7 ppm)。</p><p>2の分子式は、4,9-anhydro-5,6,11-trideoxyTTX (4)と一致した。また、2を各種NMR (600 MHz, CD₃COOD-D₂O 4:96, v/v)に供したところ、そのシグナルは4 ⁶⁾に類似していたが、2ではH5のシグナルが一つしか示されず、かつH9の大きな高磁場シフト (-0.73 ppm)が観測された。C5、C10のケミカルシフト (50.7, 107.6 ppm)、及び、C5/H9, C10/H4a, C10/H6のHMBC相関が観測されたことから、2はこれまで報告例のない、C5とC10が直接結合した10-hemiketal構造を持つと考えられた。2のNOESY 1DではH4a/H6のNOEが観測されたが、H4a/H8, H6/H8のNOEは観測されなかった。このことからC6の立体化学はTTXと同じであり、C8位はイモリに特異的な8-epi体であると考えられた ⁴⁾。以上より、2の構造を4,9-anhydro-10-hemiketal-8-epi- 5,6,11-trideoxyTTXと推定した (Fig. 1)。</p><p>(View PDFfor the rest of the abstract.)</p>

著者

工藤 雄大 此木 敬一 長 由扶子 安元 健 山下 まり

出版者

天然有機化合物討論会

雑誌

天然有機化合物討論会講演要旨集

巻号頁・発行日

no.53, pp.367-372, 2011-09-02

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Tetrodotoxin (TTX) is distributed in wide range of animals, marine puffer fish and terrestrial newts and frogs, for examples. We have isolated various TTX analogs from these animals, and attempted to obtain clues to biosynthetic pathway of TTX from the structures of these analogs. Here we isolated four new analogs of TTX from the Okinawan newt Cynops ensicauda popei, and determined their structures as 8-epi-5,6,11-trideoxyTTX, its 4,9-anhydro derivative, its 1-hydroxy derivative, and its 1-hydroxy-4,4a-anhydro derivative, by spectroscopic method. These analogs are not detected in puffer fish, instead, 5,6,11-trideoxyTTX is detected as a major analog in puffer fish eggs. 1-Hydroxy type analog might be specific to newts, since 1-hydroxy-5,11-dideoxyTTX was previously isolated from the other species of newt, Taricha granulosa, by other group. This is the first identification of 4,4a-anhydro type analog of TTX from the natural source.

著者

山下 まり

出版者

東北大学

雑誌

特定領域研究(A)

巻号頁・発行日

2000

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中南米に生息するAtelopus(ヤセヤドクガエル)属のカエルの多くは、主に皮膚に水溶性毒を有する。1975年にコスタリカ産のAtelopus属のカエルからtetrodotoxinが同定されたが、zetekitoxinはすでに1969年に、Furman,Mosherによってパナマ産のA.zetekiに存在する新規の水溶性低分子毒として報告された。しかし、zetekitoxinは、その後、A.zetekiが保護条約下に置かれ、試料が入手出来なくなったことから、その構造は発見から約30年間未定であった。韓国科学技術院のY.H.Kim教授から規制前に精製された半精製品及び精製品のzetekitoxinを供与された。本研究は立体構造を含めたzetekitoxinの構造決定を行うことを目的とした。1.精製Biogel P-2,BioRex70,Hitachi gel3011Cを用いたHPLCで半精製品のzetekitoxinを精製し、純品を約300-400μg得た。2.性状FT-IR(ZnSe)1702,1561,1421,1338,1268cm^<-1>;HR-ESIMS[M+H]^+m/z553.1369(calcd for[C_<16>H_<25>N_8O_<12>S_1]^+m/z553.1313.[M-SO_3+H]^+m/z473.1725(calcd for[C_<16>H_<25>N_8O_9]^+m/z473.1744.この結果から、硫酸エステルの存在が示唆された。TLC(Silica gel 60)Pyr-EtOAc-AcOH-H_2O(15:7:3:6)Rf0.57(tetrodotoxin:0.50,saxitoxin:0.36).saxitoxinと同様に1%H_2O_2/H_2O(v/v)噴霧、加熱後にUV365nmで蛍光スポットとして検出された。3.NMRスペクトルと平面構造の推定NMRスペクトルは全て4%CD_3COOD/D_2O中、20℃か30℃で測定した。^1H-^1HCOSY,TNTOCSY,HSQC,HMBC,NOESY,NOE差,^<13>C NMRスペクトルの解析から、saxitoxin骨格を部分構造にウレタン、N-OHをもつ、非常に特異な新規構造を推定した。

著者

長澤 和夫 山下 まり

出版者

東京農工大学

雑誌

基盤研究(B)

巻号頁・発行日

2008

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電位依存型NaChには9つのサブタイプが存在し、これらは各々が、痛覚、心拍、筋肉伸縮等の重要な生命活動と密接に関係している。本研究では電位依存型NaChの阻害剤である貝毒サキシトキシン(STX)類縁化合物を、NaChサブタイプ選択的なリガンドとして開発するための基盤構築を目的とした。その結果、STX類の一般的な合成法の開発に成功し、種々のSTX類縁体の合成に成功した。また合成研究過程で新規STX骨格(FD-STX)を見いだし、これをもとにFD-STX, FD-doSTX, FD-dcSTXの合成に成功した。得られた化合物のNaCh阻害活性について評価した結果、今回合成した誘導体類はいずれも天然のSTXに比べ1/10~1/100倍阻害活性が低下した。一方、サブタイプ選択性では、FD-dcSTXが、テトロドトキシン-抵抗型のNa_V1. 5に対して、非可逆的に結合することを見いだした。