著者

若山 照彦 幸田 尚 小保方 晴子 野老 美紀子 リ チョン 寺下 愉加里 水谷 英二 グェン ヴァン トン 岸上 哲士 若山 清香 石野 史敏

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第106回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.P-102, 2013 (Released:2013-09-10)

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【目的】哺乳動物のクローン作出は,優良家畜の大規模な生産や絶滅危惧種の保全を可能にする新しい技術として期待されてる。しかし現在の成功率では一度に大量のクローン動物を作ることは出来ないため,クローン動物の体細胞から再びクローン動物を作り出す連続核移植(再クローニング)技術が必要だと考えられていた。ところがこれまでの報告では,再クローニングを繰り返すごとに出産率は低下し,マウスで6世代,ウシやネコで2世代までが限界だった。この原因は,クローン技術特有の「初期化異常」が,核移植を行うたびに蓄積するためと考えられていたが,成功率が低すぎるため検証できていなかった。そこで今回我々は,最新の技術を用いて再クローニングに限界があるのか確かめてみた。 【方法】我々は2005年にトリコスタチン A(TSA)が初期化を促進し,クローンマウスの出産率を大きく改善できることを発見した。そこでTSAを用いて1匹のドナーマウス(BD129F1)からクローンマウスを作り(G1と呼ぶ),このクローンマウスが3カ月齢になった段階で再びクローンマウスを作製した(これをG2と呼ぶ)。以降これを繰り返した。生まれた再クローンマウスについて,テロメアや妊性,網羅的遺伝子発現などを調べ,自然マウスおよびG1クローンマウスと比較し,エピジェネティック異常が蓄積されるか調べた。 【結果】現時点で27世代,合計645匹のクローンを作ることに成功している。核移植の出産率は1世代目の7%から上昇傾向を示し,最高で15%を記録している。G20クローンの繁殖能力,寿命,テロメアの長さなどに異常は見られなかった。また網羅的遺伝子発現解析により核移植を繰り返しても初期化異常は蓄積しないことが明らかとなった。これらの結果は,再クローニングはほぼ無限に繰り返せることを示している。Wakayama et al., Cell Stem Cell 2013.

著者

小野 哲男 水谷 英二 李 羽中 菓子野 康浩 若山 照彦

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第102回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.1033, 2009 (Released:2009-09-08)

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【目的】葉緑体は植物や藻類にみられる細胞内小器官だが、その起源はシアノバクテリアの一種と考えられており、10数億年前に真核生物に1度だけ細胞内共生(1次共生)して葉緑体になったといわれている。本実験では、シアノバクテリアをマウス卵に注入することで人為的に一次共生を再現し、共生の条件検討および胚発生に与える影響を調べた。【方法】まず、注入用培地の検討を行うため、シアノバクテリア(Synechocystis sp. PCC 6803)を10%PVP-H-CZB、H-CZB、NIMに懸濁後、1個、5-10個、20個、それ以上(~100個)をB6D2F1マウスの未受精卵に注入し、生存率、単為発生後の発生率および注入数の影響を調べた。次に注入先の環境の影響を調べるために、未受精卵、単為発生胚(1nあるいは2n)、および受精卵へ注入し、同様な観察を行った。受精卵については細胞質内だけでなく前核内への注入も試みた。注入後に胚盤胞期まで発生した胚は培養を継続し、シアノバクテリアを細胞内にもつES細胞の樹立を試みた。【結果】シアノバクテリアはマニュピュレーターで卵子内へ注入可能であり、またクロロフィルの自家蛍光により染色なしで存在を観察できた。注入用培地の違い、および受容する胚の違いによる胚発生への影響は見られなかった。しかし注入数に関係なく胚の中でシアノバクテリアの増殖は見られず、50個以上のシアノバクテリアを注入した胚の多くは発生が阻害された。さらに、胚盤胞期でシアノバクテリアの存在が確認された胚からES細胞の樹立を試みたが、細胞内にシアノバクテリアの存在が確認できたものの、ここでもやはり増殖は見られなかった。また、発生過程でのシアノバクテリアの細胞質内分布はランダムで、細胞分裂に伴って各娘細胞へ伝わっているのが観察された。今後培養温度や、培養中に光合成可能な光を当てるなどさらなる改良を加えることで卵子内のシアノバクテリアを増殖させることができれば、葉緑体マウスの作出も可能になるかもしれない。

著者

若山 照彦 水谷 英二

出版者

山梨大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

2011-04-01

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絶滅あるいは絶滅危惧種を復活させることができれば、失われた遺伝子の機能解析や産物利用が可能となる。研究代表者らはそのための基礎研究として、核移植技術を根本から見直し改善するのと同時に、クローン個体の大量生産の方法や、凍結死体、毛皮、糞や尿に含まれる細胞からクローン個体の作出を目指した。その結果、最新の技術を用いればクローン動物からクローン動物を作りだすことで無限生産の可能性を示し、また、尿に含まれている細胞からクローンを作りだすことに成功した。

著者

若山 照彦 岸上 哲士 長友 啓明 大我 政敏 水谷 英二

出版者

山梨大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

2016-04-01

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今年度は、クローンマウスの研究において念願だったF1以外の卵子からのクローン作出に成功した(Tanabe et al., Reproduction 2017)。最も安く購入できるICR系統の卵子が利用可能となっただけでなく、系統間で卵子の初期化能力を比較することが可能となった。また、核の保存限界を明らかにする研究では、国際宇宙ステーション内で宇宙放射線に長期間曝したフリーズドライ精子であっても顕微授精によって産仔を得ることが可能であり、精子核に対するDNA損傷はわずかであることを初めて証明した(Wakayama S. et al., PNAS 2017)。この成果は主要な全国紙およびNHKなどのテレビで報道されただけでなく、海外でも広く紹介された。またこの研究において、ダメージを受けた精子核は卵子内で修復されていることを明らかにした。糞由来細胞核からのクローンマウス作出の試みでは、安定した核の採取に成功し、卵子内で移植した核のDNA修復が確認されたが(投稿中)、現時点で初期発生には成功していない。一方、活性化した卵子内の核の変化および初期化については、今まで生きたまま観察することは出来なかったが、今回我々は、zFLAPという新技術を開発し、生きたままダメージを与えずに核の変化を観察することに成功した(Ooga & Wakayama PlosOne 2017)。核移植や胚移植のためには、卵子や胚を保護するだけでなく顕微操作において卵子や胚を固定するために透明帯が不可欠である。そこで、人工卵子が作出できた場合のために、人工透明帯の開発を行ったところ、アガロースで作られたカプセルであれば透明帯の代替品となることを明らかにした(Nagatomo et al., Scientific Reports 2017)。

著者

若山 照彦 幸田 尚 小保方 晴子 野老 美紀子 リ チョン 寺下 愉加里 水谷 英二 グェン ヴァン トン 岸上 哲士 若山 清香 石野 史敏

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.106, pp.P-102-P-102, 2013

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【目的】哺乳動物のクローン作出は,優良家畜の大規模な生産や絶滅危惧種の保全を可能にする新しい技術として期待されてる。しかし現在の成功率では一度に大量のクローン動物を作ることは出来ないため,クローン動物の体細胞から再びクローン動物を作り出す連続核移植(再クローニング)技術が必要だと考えられていた。ところがこれまでの報告では,再クローニングを繰り返すごとに出産率は低下し,マウスで6世代,ウシやネコで2世代までが限界だった。この原因は,クローン技術特有の「初期化異常」が,核移植を行うたびに蓄積するためと考えられていたが,成功率が低すぎるため検証できていなかった。そこで今回我々は,最新の技術を用いて再クローニングに限界があるのか確かめてみた。 【方法】我々は2005年にトリコスタチン A(TSA)が初期化を促進し,クローンマウスの出産率を大きく改善できることを発見した。そこでTSAを用いて1匹のドナーマウス(BD129F1)からクローンマウスを作り(G1と呼ぶ),このクローンマウスが3カ月齢になった段階で再びクローンマウスを作製した(これをG2と呼ぶ)。以降これを繰り返した。生まれた再クローンマウスについて,テロメアや妊性,網羅的遺伝子発現などを調べ,自然マウスおよびG1クローンマウスと比較し,エピジェネティック異常が蓄積されるか調べた。 【結果】現時点で27世代,合計645匹のクローンを作ることに成功している。核移植の出産率は1世代目の7%から上昇傾向を示し,最高で15%を記録している。G20クローンの繁殖能力,寿命,テロメアの長さなどに異常は見られなかった。また網羅的遺伝子発現解析により核移植を繰り返しても初期化異常は蓄積しないことが明らかとなった。これらの結果は,再クローニングはほぼ無限に繰り返せることを示している。Wakayama et al., Cell Stem Cell 2013.

著者

水谷 英二 長友 啓明 若山 照彦

出版者

東京大学

雑誌

基盤研究(B)

巻号頁・発行日

2015-04-01

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核移植技術では核そのものを操作するが、それよりも小さな単位、すなわち染色体を操作するための技術開発を試みた。特定の染色体をラベルするためsuntag systemを使用し、ES細胞中のY染色体をラベルすることに成功し任意の染色体をラベルできる可能性を示した。また胚の染色体を分散させることで、生きた胚間での染色体移植が可能であることを示した。しかしながら、胚において特定染色体をラベルして操作するには至らなかった。加えて、染色体操作の使用が想定される絶滅危惧種において、個体を傷つけずに採取可能な尿中に含まれる極わずかな細胞から、クローン個体およびntES細胞株が樹立可能であることを示した。