著者

若山 照彦 幸田 尚 小保方 晴子 野老 美紀子 リ チョン 寺下 愉加里 水谷 英二 グェン ヴァン トン 岸上 哲士 若山 清香 石野 史敏

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第106回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.P-102, 2013 (Released:2013-09-10)

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【目的】哺乳動物のクローン作出は,優良家畜の大規模な生産や絶滅危惧種の保全を可能にする新しい技術として期待されてる。しかし現在の成功率では一度に大量のクローン動物を作ることは出来ないため,クローン動物の体細胞から再びクローン動物を作り出す連続核移植(再クローニング)技術が必要だと考えられていた。ところがこれまでの報告では,再クローニングを繰り返すごとに出産率は低下し,マウスで6世代,ウシやネコで2世代までが限界だった。この原因は,クローン技術特有の「初期化異常」が,核移植を行うたびに蓄積するためと考えられていたが,成功率が低すぎるため検証できていなかった。そこで今回我々は,最新の技術を用いて再クローニングに限界があるのか確かめてみた。 【方法】我々は2005年にトリコスタチン A(TSA)が初期化を促進し,クローンマウスの出産率を大きく改善できることを発見した。そこでTSAを用いて1匹のドナーマウス(BD129F1)からクローンマウスを作り(G1と呼ぶ),このクローンマウスが3カ月齢になった段階で再びクローンマウスを作製した(これをG2と呼ぶ)。以降これを繰り返した。生まれた再クローンマウスについて,テロメアや妊性,網羅的遺伝子発現などを調べ,自然マウスおよびG1クローンマウスと比較し,エピジェネティック異常が蓄積されるか調べた。 【結果】現時点で27世代,合計645匹のクローンを作ることに成功している。核移植の出産率は1世代目の7%から上昇傾向を示し,最高で15%を記録している。G20クローンの繁殖能力,寿命,テロメアの長さなどに異常は見られなかった。また網羅的遺伝子発現解析により核移植を繰り返しても初期化異常は蓄積しないことが明らかとなった。これらの結果は,再クローニングはほぼ無限に繰り返せることを示している。Wakayama et al., Cell Stem Cell 2013.

著者

小野 哲男 水谷 英二 李 羽中 菓子野 康浩 若山 照彦

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第102回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.1033, 2009 (Released:2009-09-08)

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【目的】葉緑体は植物や藻類にみられる細胞内小器官だが、その起源はシアノバクテリアの一種と考えられており、10数億年前に真核生物に1度だけ細胞内共生(1次共生)して葉緑体になったといわれている。本実験では、シアノバクテリアをマウス卵に注入することで人為的に一次共生を再現し、共生の条件検討および胚発生に与える影響を調べた。【方法】まず、注入用培地の検討を行うため、シアノバクテリア(Synechocystis sp. PCC 6803)を10%PVP-H-CZB、H-CZB、NIMに懸濁後、1個、5-10個、20個、それ以上(~100個)をB6D2F1マウスの未受精卵に注入し、生存率、単為発生後の発生率および注入数の影響を調べた。次に注入先の環境の影響を調べるために、未受精卵、単為発生胚(1nあるいは2n)、および受精卵へ注入し、同様な観察を行った。受精卵については細胞質内だけでなく前核内への注入も試みた。注入後に胚盤胞期まで発生した胚は培養を継続し、シアノバクテリアを細胞内にもつES細胞の樹立を試みた。【結果】シアノバクテリアはマニュピュレーターで卵子内へ注入可能であり、またクロロフィルの自家蛍光により染色なしで存在を観察できた。注入用培地の違い、および受容する胚の違いによる胚発生への影響は見られなかった。しかし注入数に関係なく胚の中でシアノバクテリアの増殖は見られず、50個以上のシアノバクテリアを注入した胚の多くは発生が阻害された。さらに、胚盤胞期でシアノバクテリアの存在が確認された胚からES細胞の樹立を試みたが、細胞内にシアノバクテリアの存在が確認できたものの、ここでもやはり増殖は見られなかった。また、発生過程でのシアノバクテリアの細胞質内分布はランダムで、細胞分裂に伴って各娘細胞へ伝わっているのが観察された。今後培養温度や、培養中に光合成可能な光を当てるなどさらなる改良を加えることで卵子内のシアノバクテリアを増殖させることができれば、葉緑体マウスの作出も可能になるかもしれない。

著者

若山 照彦 水谷 英二

出版者

山梨大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

2011-04-01

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絶滅あるいは絶滅危惧種を復活させることができれば、失われた遺伝子の機能解析や産物利用が可能となる。研究代表者らはそのための基礎研究として、核移植技術を根本から見直し改善するのと同時に、クローン個体の大量生産の方法や、凍結死体、毛皮、糞や尿に含まれる細胞からクローン個体の作出を目指した。その結果、最新の技術を用いればクローン動物からクローン動物を作りだすことで無限生産の可能性を示し、また、尿に含まれている細胞からクローンを作りだすことに成功した。

著者

若山 照彦 岸上 哲士 長友 啓明 大我 政敏 水谷 英二

出版者

山梨大学

雑誌

基盤研究(A)

巻号頁・発行日

2016-04-01

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今年度は、クローンマウスの研究において念願だったF1以外の卵子からのクローン作出に成功した(Tanabe et al., Reproduction 2017)。最も安く購入できるICR系統の卵子が利用可能となっただけでなく、系統間で卵子の初期化能力を比較することが可能となった。また、核の保存限界を明らかにする研究では、国際宇宙ステーション内で宇宙放射線に長期間曝したフリーズドライ精子であっても顕微授精によって産仔を得ることが可能であり、精子核に対するDNA損傷はわずかであることを初めて証明した(Wakayama S. et al., PNAS 2017)。この成果は主要な全国紙およびNHKなどのテレビで報道されただけでなく、海外でも広く紹介された。またこの研究において、ダメージを受けた精子核は卵子内で修復されていることを明らかにした。糞由来細胞核からのクローンマウス作出の試みでは、安定した核の採取に成功し、卵子内で移植した核のDNA修復が確認されたが(投稿中)、現時点で初期発生には成功していない。一方、活性化した卵子内の核の変化および初期化については、今まで生きたまま観察することは出来なかったが、今回我々は、zFLAPという新技術を開発し、生きたままダメージを与えずに核の変化を観察することに成功した(Ooga & Wakayama PlosOne 2017)。核移植や胚移植のためには、卵子や胚を保護するだけでなく顕微操作において卵子や胚を固定するために透明帯が不可欠である。そこで、人工卵子が作出できた場合のために、人工透明帯の開発を行ったところ、アガロースで作られたカプセルであれば透明帯の代替品となることを明らかにした(Nagatomo et al., Scientific Reports 2017)。

著者

若山 照彦

出版者

山梨大学

雑誌

特定領域研究

巻号頁・発行日

2008

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ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤を用いてクローン技術の成功率を改善することに成功し、この技術を用いることで16年間凍結保存されていた死体からのクローンマウスの作出に成功した。一方、従来再クローニングには限界があると言われていたが、この技術により再クローンを25回以上繰り返すことに成功し、1匹のドナーマウスから600匹ものクローンマウスを作ることに成功した。初期化異常は蓄積されないことが初めて示された。

著者

若山 照彦

出版者

独立行政法人理化学研究所

雑誌

若手研究(A)

巻号頁・発行日

2003

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卵子及び精子の凍結保存には定期的な液体窒素の補充が不可欠であり、長期間安全に維持するためには膨大な経費が必要である。そこで我々は精子および卵子の簡便な室温(非凍結)保存法の開発を試みた。従来の凍結保存に使われている試薬(グリセロールなど)は非凍結保存では毒性を示し、保存後の精子から産子を作ることはできなかった。しかし我々は高濃度のNaClを保存液に加えると精子の保存性が促進されることを発見した。この「塩漬け」方法では、保存中の精子の先体部が破けるなどのダメージが生じ、すべての精子が保存直後に死滅してしまうが、顕微受精技術によってそれらの精子を卵子内へ注入することで室温では10日間、4℃では2ヶ月間保存しても高率に産子へ発育させることが可能になった(Thaun et al., 2005)。これは従来の記録(室温で3日、4℃で1週間)を大幅に塗り替えている。以前我々は精子の凍結乾燥法を開発したが、今回の方法は高価な凍結乾燥機を必要とせず、より簡便な方法である。一方我々はこの方法が卵子にも効果があるかどうか検討してみた。その結果室温で24時間保存した卵子から顕微受精によって産子を作出することに世界で始めて成功した(Wakayama et al., 2004)。これまで卵子の室温保存は数時間が限度とされていたことから、本方法は精子だけでなく卵子においても有効であることが示されている。これらの研究から生殖細胞の保存にはDNAにダメージがなければ、細胞の生き死には重要ではないことが明らかとなった。また我々は生殖細胞を持たない不妊マウスからでも、体細胞核移植技術などを利用して子孫を作出する方法も開発中である(Wakayama et al., 2005)。

著者

眞鍋 昇 宮野 隆 酒巻 和弘 若山 照彦 杉本 実紀 中山 瑞穂

出版者

東京大学

雑誌

学術創成研究費

巻号頁・発行日

2001

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脊椎動物は多様な生殖戦略をもつ。魚類の多くは数万〜数億のなかで幸運で優れた仔だけが生き残る。逆に、哺乳類は性周期毎に1〜10個の卵母細胞を排卵し、極わずかの仔を産み、それを大切に育てる。成熟した哺乳類卵巣には、胎児期に減数分裂の途中・ディプロテン期で休止した5〜100万個の卵母細胞が含まれ、これが性周期毎に発育・成熟して排卵に至る。この過程で、最終的に排卵にいたるものの100倍以上の卵胞が発達を開始し、99%以上が選択的に死滅する。この卵胞の選択的死滅は優秀で強靭な子孫を残す戦略として重要であるが、これを調節している分子制御機構は未解明である。本研究は、哺乳類卵巣において繰返される卵胞の選択的死滅を支配している分子機構を解明し、これをもとに細胞死を制御している遺伝子の発現をin vivo制御することで卵胞発育を人為的に支配しようとするものである。この新技術で、食肉処理場で捨てられる卵巣内の卵母細胞の有効利用を実現しようとしている。今年度は実証的研究に注力した。卵胞顆粒層細胞に特異的に発現している新規細胞死受容体を認識するユニークなモノクロナル抗体を用いてデコイ受容体を同定し、その発現動態を明らかとした。さらに細胞死受容体を介する細胞内アポトーシスシグナル伝達系を担うカスパーゼ系を阻害するcFLIPを見いだして遺伝子とアミノ酸配列を決定した。これの発現を腫瘍壊死因子α調節し、その制御に多面的機能をもつinterleukin-6が重要に関わっていることを示唆した。併行して、大型家畜の未成熟な卵胞を含む卵巣片を免疫不全マウス腎漿膜嚢に異種移植し、in vivo遺伝子導入とRNA発現阻止(iRNA)にて人為的に制御できるシステムを開発した。

著者

若山 清香 三宅 正史 若山 照彦

出版者

日本哺乳動物卵子学会

雑誌

Journal of mammalian ova research = 日本哺乳動物卵子学会誌 (ISSN:13417738)

巻号頁・発行日

vol.22, no.3, pp.152-158, 2005-10-01

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近年、胚性幹細胞(ES細胞)を用いた再生医療への応用研究が始まっているが、免疫拒絶反応に関する問題は依然として解決していない。そこで免疫拒絶反応の起こりえない、患者自身の体細胞から核移植技術によって作りだされたES細胞の研究に注目が集まってきた。これまでの研究から、核移植で作られた体細胞由来胚性幹細胞(nES細胞)は受精卵由来ES細胞と同様に多能性を持ち、キメラマウスの生殖細胞にも寄与できることが分かっている。また、その樹立効率にはマウスの系統差や性差による違いが認められず、核移植に用いるドナー細胞の由来に依存しないこと、さらにはそのnES細胞の樹立する効率が高いことなども明らかとなっている。しかし、ES細胞とnES細胞がまったく同質なものか吏に検討する必要があると考えられる。本稿ではこれまでに明らかになったnES細胞の特性およびその応用例について紹介する。

著者

若山 清香 岸上 哲士 若山 照彦

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集 第100回日本繁殖生物学会大会

巻号頁・発行日

pp.20106, 2007 (Released:2007-10-17)

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私たちは以前に、クローンマウスの体細胞(卵丘細胞)からでもクローンマウスを作出できることを報告した。しかし、クローンマウスの成功率は世代を経るたびに徐々に低下し、たった1匹の6世代目のクローンマウスも食殺され、7世代目以降のクローンマウスを作成することはできなかった。クローン牛の場合は2世代目までと報告されている。しかし、当時のクローンマウスの成功率は1-2%であり、コントロール実験ですら産仔の作出に失敗することがたびたびあり、再クローニングに失敗した原因が、再クローニングには限界があるのか、成功率の低さが原因で失敗しただけなのか結論できなかった。[方法] 近年われわれの研究室ではTrichostatin A(TSA)を培地に加えることによってクローンマウスの成功率を劇的に改善することに成功した。そこでTSAを用いて再クローン実験を再挑戦することにした。最初に1匹のBD129F1(BDF1 x 129/Sv:三元交配)をドナーマウスに選び、2-3ヶ月齢で卵丘細胞を採取して最初の世代(G1)のクローンマウスを作出した。G2以降、同様に繰り返した。[結果] 現在までに7世代目まで生まれており、合計すると100匹以上のクローンマウスが1匹のドナーマウスから生まれたことになる。クローンマウスの成功率は1世代目18.0%、2世代目5.0%、3世代目4.5%、4世代目7.4%、5世代目13.2%、6世代目7.0%、7世代目6.5%であり、世代間でのばらつきは大きいが、世代が進んでも成功率の低下は見られなかった。また、いずれの世代においても体重と胎盤重量、および産直死率は通常のクローンマウスと同程度だった。現在7世代目のマウスは多数生存しており、間もなく8世代目を試みる予定である。[考察] 7世代目までの結果で結論を出すことはできないが、少なくとも現時点では再クローニングによる成功率の低下は見られないことから、クローン作成技術をより向上させることに成功すれば、クローン動物を無限に作り続けることができるようになるのではないだろうか。

著者

若山 照彦 幸田 尚 小保方 晴子 野老 美紀子 リ チョン 寺下 愉加里 水谷 英二 グェン ヴァン トン 岸上 哲士 若山 清香 石野 史敏

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.106, pp.P-102-P-102, 2013

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【目的】哺乳動物のクローン作出は,優良家畜の大規模な生産や絶滅危惧種の保全を可能にする新しい技術として期待されてる。しかし現在の成功率では一度に大量のクローン動物を作ることは出来ないため,クローン動物の体細胞から再びクローン動物を作り出す連続核移植(再クローニング)技術が必要だと考えられていた。ところがこれまでの報告では,再クローニングを繰り返すごとに出産率は低下し,マウスで6世代,ウシやネコで2世代までが限界だった。この原因は,クローン技術特有の「初期化異常」が,核移植を行うたびに蓄積するためと考えられていたが,成功率が低すぎるため検証できていなかった。そこで今回我々は,最新の技術を用いて再クローニングに限界があるのか確かめてみた。 【方法】我々は2005年にトリコスタチン A(TSA)が初期化を促進し,クローンマウスの出産率を大きく改善できることを発見した。そこでTSAを用いて1匹のドナーマウス(BD129F1)からクローンマウスを作り(G1と呼ぶ),このクローンマウスが3カ月齢になった段階で再びクローンマウスを作製した(これをG2と呼ぶ)。以降これを繰り返した。生まれた再クローンマウスについて,テロメアや妊性,網羅的遺伝子発現などを調べ,自然マウスおよびG1クローンマウスと比較し,エピジェネティック異常が蓄積されるか調べた。 【結果】現時点で27世代,合計645匹のクローンを作ることに成功している。核移植の出産率は1世代目の7%から上昇傾向を示し,最高で15%を記録している。G20クローンの繁殖能力,寿命,テロメアの長さなどに異常は見られなかった。また網羅的遺伝子発現解析により核移植を繰り返しても初期化異常は蓄積しないことが明らかとなった。これらの結果は,再クローニングはほぼ無限に繰り返せることを示している。Wakayama et al., Cell Stem Cell 2013.

著者

岸上 哲士 若山 照彦 佐伯 和弘

出版者

近畿大学

雑誌

基盤研究(B)

巻号頁・発行日

2007

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世界初のクローンヒツジ「ドリー」の報告以来、クローン動物の作出効率は動物種によらずわずか数%と低率であった。本研究代表者は、クローン胚をヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACi)、トリコスタチンA(trichostatin A, TSA)で処理することでクローンマウスの作出効率が大幅に改善されることを発見した。本課題ではその作出効率改善の機構解明として発生におけるHDAC酵素やタンパク質アセチル化の重要性を明らかにし、さらにこれまで不可能であったマウス系統からのクローンマウスの作出に世界で初めて成功した。

著者

若山 照彦

出版者

独立行政法人理化学研究所

雑誌

特定領域研究

巻号頁・発行日

2003

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我々はクローン動物および体細胞由来ntES細胞を効率よく作出する方法の開発および初期化のメカニズムの解明を試みている。昨年我々はntES細胞と受精卵由来のES細胞には違いが見られないことを証明したが、19年度はさらに詳しい比較と倫理問題の解決を試みた。我々は核移植の影響を調べるために、単為発生ES細胞を用いた遺伝子発現解析法を確立し、これによってついに我々は特定の遺伝子におけるメチル化状態について、ntES細胞とES細胞の間に違いがあることを発見した。現在このntES細胞特異的なDNAメチル化状態の違いが、その後の細胞分化や応用にどのような影響を与えるのか解析中である(Hikichi, et. al., 2007,2008)。一方倫理問題の解決については2つのアプローチを試みた。体外受精に失敗した卵子は、加齢により質が低下することから廃棄されている。この廃棄卵子を用いれば健康な女性から卵子を提供してもらうという倫理問題は解決する。そこでマウスを用いたモデル実験を行った結果、体外受精に失敗した卵子でも核移植およびntES細胞の作成には問題ないことを明らかにした(Wakayama, et. al., 2007a)。この成果は多数の全国紙やテレビで紹介された。また、胚を殺さずに1割球(細胞)を取り出し、そこからES細胞を樹立する手法を開発し、生命の萌芽である胚を壊すという問題についても回避できることを明らかにした(Wakayama, et. al., 2007b)。他に核移植技術をより簡素化した手法についての研究も報告した(Kishigami, et. al., 2007;Wakayama, et. al., 2008)。

著者

水谷 英二 長友 啓明 若山 照彦

出版者

東京大学

雑誌

基盤研究(B)

巻号頁・発行日

2015-04-01

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核移植技術では核そのものを操作するが、それよりも小さな単位、すなわち染色体を操作するための技術開発を試みた。特定の染色体をラベルするためsuntag systemを使用し、ES細胞中のY染色体をラベルすることに成功し任意の染色体をラベルできる可能性を示した。また胚の染色体を分散させることで、生きた胚間での染色体移植が可能であることを示した。しかしながら、胚において特定染色体をラベルして操作するには至らなかった。加えて、染色体操作の使用が想定される絶滅危惧種において、個体を傷つけずに採取可能な尿中に含まれる極わずかな細胞から、クローン個体およびntES細胞株が樹立可能であることを示した。

著者

若山 照彦

出版者

エヌ・ティー・エス

雑誌

遺伝 : 生物の科学 (ISSN:03870022)

巻号頁・発行日

vol.67, no.5, pp.631-637, 2013-09