著者

渡辺 伸也 高橋 清也 赤木 悟史 水町 功子 松田 秀雄 米内 美晴 片山 努 横山 紅子 高橋 正弘 上田 淳一 長谷川 清寿 志賀 一穂

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.99, pp.149, 2006

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【目的】わが国では,多数の体細胞クローン牛が生産されており,これらの牛を対象とした一連の飼養・繁殖試験を通じ,雌雄のクローン牛の成長や繁殖に関する健全性のデータが収集されている。しかしながら,クローン牛由来乳のリスク評価に重要といわれる乳中アレルゲンに関するデータ収集は不十分である。本研究では体細胞クローン牛およびその後代牛が生産した乳中のβ-ラクトグロブリン(BLG)の遺伝的変異体(多型)のタイプ(ホルスタイン種では、通常、A型,B型およびAB型の3種類)を調査した。【方法】泌乳中の体細胞クローン牛:11頭(ホルスタイン種:9頭,黒毛和種:2頭),体細胞クローン後代牛:6頭(ホルスタイン種),5頭の体細胞クローン牛(ホルスタイン種)に共通のドナー牛:1頭および対照牛:17頭(ホルスタイン種:15頭、黒毛和種:2頭)より乳を採取し,その中に含まれるBLGのタイプをBLG特異的抗体(森永生化学研究所製)を用いたウエスタンブロット法で解析した。【結果と考察】調査したホルスタイン種におけるBLGタイプは,体細胞クローン牛で,A型:2頭,B型:1頭,AB型:6頭,後代牛で,A型:0頭,B型:2頭,AB型:4頭,また,対照牛で,A型:4頭,B型:4頭,AB型:7頭であった。ドナー牛とこの牛の体細胞より生産されたクローン牛(5頭)に由来する乳のBLGタイプは全て同一(AB型)であった。一方,調査した黒毛和種におけるBLGタイプは,体細胞クローン牛2頭 (同じ体細胞由来) で,ともにB型,対照牛で,A型:0頭,B型:1頭,AB型:1頭であった。以上の結果は,体細胞クローン操作が,生産されたクローン牛やその後代牛の乳中BLGにおける遺伝的変異体のタイプに影響を及ぼしていないことを示唆している。

著者

岡崎 哲司 三原 敏敬 JoAnne S Richards Zhilin Liu 島田 昌之

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.102, pp.2, 2009

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【目的】我々はブタ精液中の細菌数と精子運動性には負の相関関係が存在し、細菌感染の悪影響は細菌増殖抑制作用を示す抗生物質では効果はなく、グラム陰性菌膜成分のLPSを不活化させるPMBにより抑制可能となることを明らかとした。このことから、細菌から放出されるLPSが精子に直接的に影響を与えていると推察されるが、精子の細菌認識について、全く報告がない。そこで、本研究ではLPS及びグラム陽性菌膜成分を認識し、初期免疫応答を司るTLR4及びTLR2の精子での発現と、そのKOマウスを用いて、精子における自然免疫能の役割を解析した。【方法】8週齢の雄マウスの精巣上体から精子を回収し、LPSまたはTLR2リガンドPam3Cysで処理し、精子機能性解析のためのサンプルを経時的に回収した。また、一部の精子は体外受精あるいは人工授精に供試した。【結果】マウス精子においてTLR4とTLR2の発現がmRNA及びタンパク質レベルで認められ、TLR4は先体及び尾部に、TLR2は尾部に局在していた。WTマウスではLPSまたはPam3Cysの添加濃度依存的に運動・生存率は低下し、培養3時間までに先体損傷が観察された。さらに、これらの精子ではNFkBのリン酸化、Caspase-3の活性化が生じ、アポトーシスを誘起していた。一方で、<I>Tlr4-/-</I>マウス精子ではLPS、<I>Tlr2-/-</I>マウス精子ではPam3Cysによる運動性低下、先体反応は全く起こらず、Caspase-3によるアポトーシスも完全に抑制されたが、<I>Tlr4-/-</I>マウス精子にPam3Cys,<I>Tlr2-/-</I>マウス精子にLPS処理するとWTと同様の結果を示した。リガンドを暴露したWTマウス精子を用いた体外受精および人工授精では、受精・卵割率が有意に低下したが、KOマウスでは、それぞれのリガンドに対して受精能低下は起こらなかった。さらに、両遺伝子欠損マウスでは、精子の運動性は長期にわたり維持され高い受精率を示した。以上の結果から、精子は自然免疫能を司るTLR4、TLR2により精液中の細菌感染を認識し、自己の機能性低下やアポトーシスを起こすことで、受精能を低下させていることが初めて明らかとなった。

著者

ボクラベック ポトツカ イザベラ コバルチック イローナ バー ママドゥ マウサ スカラジンスキ ダリウス ヤン

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.102, pp.1045, 2009

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We demonstrated that LPA is synthesized in endometrium and there is higher LPA concentration and mRNA expression for LPA1 in bovine endometrium during pregnancy than estrous cycle. Thus LPA may contribute to early pregnancy establishment. In <I>in vivo</I> study we investigated LPA effect on conception rate, P4 and PG secretion in heifers. Animals were inseminated 72 h after second PGF2α injection. From Day 15 to 18 after insemination, heifers were treated intravaginally with: saline (control), LPA (1 mg) or VPC32183 (1 mg; n = 8 for each group). Blood samples were collected on the following days after insemination: 0, 6, 12, 15, 16, 17, 18, 21 and 30. Pregnancy was confirmed by USG and <I>per rectum</I> examination on days 30 and 49. LPA administration resulted in increase in P4 and PGE2 concentrations compared to saline and VPC32183 - treated heifers (P<0.05). In saline and LPA-treated groups 6 out of 8 heifers were pregnant, whereas conception rate in VPC32183 – treated heifers was 37% (P<0.05). In <I>in vitro</I> study we examined the effects of LPA on PG secretion and <I>PGES</I> and <I>PGFS</I> mRNA expressions in stromal and epithelial cells of bovine endometrium on Days 16-18 of pregnancy and estrous cycle. LPA increased PGE2 production and <I>PGES</I> mRNA expression in stromal cells at estrous cycle and pregnancy (P<0.05). The overall results indicate that LPA serves as luteotropic factor during early pregnancy stimulating P4 and PGE2 secretion through activation of <I>PGES</I> mRNA transcript expression in stromal cells. Moreover, at pregnancy establishment, endogenous LPA protects CL and embryo development.

著者

宗像 祥久 柴原 秀典 植田 愛美 川原 玲香 白砂 孔明 桑山 岳人 岩田 尚孝

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.111, pp.AW1-5-AW1-5, 2018

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<p>【目的】卵胞液(FF)は卵子と顆粒層細胞(GC)の共通の環境である。我々は卵子の発生能力とその個体のFFの卵子成熟・発生支持能力の間に高い関係性があることを見出している。FF中にはエクソソームなどの細胞外小胞(EV)が存在しており,近年FF中EV内のmiRNAが卵胞内の細胞に影響するという報告があるが詳細は未だ明らかになっていない。本研究では卵胞発育に関与するFF中EV由来のmiRNAの探索およびその影響について検討した。【方法】(実験1)食肉センター由来ブタ卵巣の卵胞(直径1–3 mm)からFFを採取し,EV除去FFと対照FFを作成した。対照FF又はEV除去FF10%添加培地で卵子卵丘細胞複合体(COCs)を培養し,成熟率と発生率を評価した。(実験2)小(直径1–3 mm)又は大(5–7 mm)卵胞のGCのRNA-seqデータを用いて発現変動遺伝子群のIPA解析から上流因子であるmiRNAを推定した。又,大小卵胞FFからEVを抽出しsmall RNA-seqから得られたmiRNAとの比較で候補miRNAを推定した。(実験3)良好(GC数が多く卵子が高発育)と不良(GC数が少なく卵子が低発育)個体の卵巣からGCとFFを回収し,実験2と同様に候補miRNAを推定した。(実験4)対照FFとEV除去FF添加培地でCOCsを培養し,その卵丘細胞をRNA-seqに供して発現が異なる遺伝子群から上流因子であるmiRNAを推定した。(実験5)実験2–4の候補miRNAから共通miRNAを選抜し,そのmiRNAをEV除去FF添加培地に添加し卵子の能力に及ぼす影響を検証した。【結果】(実験1)EV除去FFに添加により卵子の成熟率と発生率を低下させた。(実験2–5)それぞれの結果の比較からmiR-27b,miR-17,miR-145を候補miRNAとして推定した。成熟培養へのmiR-27b添加は発生率を有意に向上させた。一方miR-17とmiR-145については胚発生率への影響は観察されなかった。</p>

著者

治田 将 難波 陽介 内山 京子 伊藤 昌彦 佐々木 慎二 絹川 将史

出版者

公益社団法人 日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.114, pp.P-14-P-14, 2021

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<p>【目的】精巣に微小石灰化が起こり,精液性状が不良になる黒毛和種種雄牛が確認されている。これらの種雄牛は,近い血縁にあり,精巣の造精機能に遺伝的な異常を抱える可能性がある。本研究では,精巣微小石灰化に関する遺伝的な要因を明らかにするため,精液性状,精巣組織の形態学的解析,RNA-seqによる精巣内遺伝子発現の網羅的解析を行った。【方法】精液および精巣は,家畜改良事業団繋養の黒毛和種種雄牛8頭(正常牛6頭,精巣微小石灰化発症牛2頭)から採取した。射出精液は,繋養開始時(0歳または1歳)から精巣採取時まで断続的に採取した。精巣の採取時年齢は,正常牛は5~14歳,発症牛は8歳および10歳であった。精液性状は,射出精液の精液量,精子濃度,総精子数,精子活力,凍結精液の融解後の精子活力で確認した。精巣組織の形態は,ブアン固定後にパラフィン包埋切片を作製し,HE染色で確認した。RNA-seqは,シーケンスリードを牛リファレンスゲノム(ARS-UCD1.2)にマッピングした後,RSEMおよびedgeRを用いて相対量の解析および統計処理を行った。【結果】2頭の発症牛は,6歳または8歳で精子濃度および総精子数が低下し,続いて精子活力が急激に低下する経過を辿った。精巣採取時点におけるこれらの種雄牛の精巣の精細管内腔には精細胞が少なく,2頭とも同様な精巣内構造の異常所見が確認された。2頭の発症牛は半兄弟であり,ほぼ同様の経過を辿っていることから,同一の遺伝的な要因の影響が示唆された。発症牛の精巣mRNA相対発現量は,1324種に有意な変動が確認された(FDR<0.01)。そのうち発現量が増加した遺伝子は1087種であり,TRH,AMDHD1,CLCC1等があった。低下した遺伝子は237種であり,PSMD1,AKAP11,SSR1等があった。また,スプライシングバリアント間の発現変動も検出された。これらの遺伝子は,精巣微小石灰化への関与が示唆された。本研究はJRA畜産振興事業による助成を受けて実施した。</p>

著者

羽田 真悟 長谷川 達也 永岡 謙太郎 南保 泰雄 松井 基純 角田 修男 今川 和彦

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.104, pp.1022, 2011

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【目的】哺乳類の着床に,gp130ファミリーのサイトカインが関与することが知られている。このファミリーのサイトカインには,マウスにおいて着床に必須もしくは重要とされるLeukemia inhibitory factor(LIF)やInterleukin-11(IL11), IL6などが含まれる。しかし,ウマでは,ゲノム解析は終了しているが,現時点においてLIFに相当する遺伝子はゲノム上になく,IL11に相当する遺伝子は機能する配列として認識されていない。我々は,これまでの研究において着床期のウマの子宮内膜でIL6の発現を確認している。そこで,本研究では,着床におけるIL6発現の経時的変化,子宮の部位による発現量の比較および発現細胞の特定を目的とした。【方法】試験には,サラブレッド種雌ウマ10頭を使用した。排卵日を0日とし,非妊娠13日(C13),妊娠13日(P13),19日(P19),25日(P25)および30日(P30)にそれぞれ2頭ずつから子宮を回収した。子宮は,胚の存在する部位(G)と逆側の子宮角の根元(N)に分けて採材した。また,P30Gにおいては,子宮内膜を卵黄嚢絨毛膜(P30GY)および尿膜絨毛膜(P30GA)と接触する部位に分けて採取した。解析は,リアルタイムPCR法により行い,各子宮内膜サンプル中のIL6 mRNAの発現量を比較した。さらに,免疫組織学的手法により子宮内膜でのIL6タンパク質の産生部位を調べた。【結果】子宮内膜のIL6 mRNAの発現は,P19Gで軽度な増加が認められ,P25GおよびP30Gでは顕著に増加していた。P30Gにおけるその発現は,P30GYと比較してP30GAでより高かった。これらの結果から,IL6 mRNAの発現は,胚の存在により固着後の子宮内膜中に誘導され,その発現は胚のカプセルが融解して胚と子宮内膜が直接接するようになる時期に重要であることが示唆される。さらに,IL6 mRNAの発現は尿膜絨毛膜に接触した部位で高く,IL6タンパク質は子宮内膜上皮の細胞に検出されたことから,IL6は,着床過程において胚と子宮内膜の接着面,特に尿膜絨毛膜との境界面で作用することが示唆され,胎盤形成などの反応に関わるものと考えられる。

著者

田崎 ゆかり 李 和容 崔 健平 アコスタ トマス J. 奥田 潔

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.103, pp.55, 2010

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【目的】黄体後期のウシ子宮由来プロスタグランジン F2&alpha; (PGF) は強力な黄体退行誘導因子として知られている。子宮の PGF と卵巣のオキシトシン (OT) の間には正のフィードバック機構が存在することが報告されている。しかし、我々はウシに OT アンタゴニストを PGF と同時に投与しても PGF の分泌は抑制されず、むしろ刺激されることを見出した。このことから PGF 分泌に OT は必須でなく、子宮で合成される PGF が局所調節因子として PGF 分泌に作用するという仮説をたてた。本研究では上記の仮説を証明するためにウシ子宮内膜における PGF 分泌への PGF の関与について多角的に検討した。【方法および結果】1) 発情周期各期 (排卵日: Day 0、黄体初期: Days 2-3、黄体形成期: Days 5-6、黄体中期: Days 8-12、黄体後期: Days 15-17、卵胞期: Days 19-21) の子宮内膜組織における PGF レセプター (<I>FPr</I>) mRNA およびタンパク発現を調べた。<I>FPr</I> mRNA 発現は黄体初期と比較して卵胞期に高く、タンパク発現は黄体初期と比較して黄体後期に高かった。また、黄体後期の子宮において FPr タンパク局在は子宮内膜上皮細胞、腺上皮、血管内皮細胞とその周辺ならびに子宮平滑筋にみとめられた。2) 黄体後期の子宮内膜組織における PGF 分泌におよぼす PGF (0.01-1 &mu;M) の影響を組織培養により検討し、EIA により解析した。PGF は黄体後期のウシ子宮内膜組織の PGF 分泌を濃度依存的に刺激した。また、PGF (1 &mu;M) の影響を黄体初期、中期および後期で比較したところ、黄体後期に強かった。さらに、PGF は単離したウシ子宮内膜上皮細胞における PGF 分泌を有意に促進したが、間質細胞に有意な影響をおよぼさなかった。【総括】ウシ子宮内膜によって合成される PGF が局所調節因子として子宮内膜上皮細胞における PGF 分泌を刺激する「自己増幅機構」の存在すること、また、ウシ子宮における PGF の自己増幅は黄体後期に強いことが示唆された。

著者

眞野 友裕 宮木 杏菜 伊川 正人 中村 肇伸

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.111, pp.AW1-6-AW1-6, 2018

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<p>【目的】精子と卵子は,受精後にリプログラミングを経て胚体外組織を含む全ての細胞に分化できる「全能性」と呼ばれる能力を再獲得する。本研究では,全能性獲得の分子基盤を明らかにするために,全能性細胞で特異的に発現する遺伝子の探索を行い,Zbed3(Zinc-finger BED Domain-containing 3)を同定した。本報告では,Zbed3の生体内での機能を明らかにすることを目的として研究を行った。【方法】着床前胚におけるZbed3のmRNAおよびタンパク質の発現はそれぞれqRT-PCRと蛍光免疫染色を用いて検討した。また,Zbed3ノックアウトマウスは,CRISPR/Cas9システムを用いて作製した。【結果】Zbed3の着床前胚における発現を検討した結果,Zbed3は受精卵から4細胞期胚の間で特異的に発現し,卵細胞膜皮質下に限局していた。Zbed3は,培養細胞を用いた研究から,Wnt/β-cateninシグナルを正に制御することが報告されているが,少なくとも初期胚では,Wnt/β-cateninシグナルの制御には関与しないことが示された。一方,Zbed3の特徴的な細胞内局在は,SCMC(subcortical maternal complex)と呼ばれる複合体の構成成分の局在と酷似していた。また,免疫沈降によりZbed3はSCMCの構成成分であるMater相互作用することが示唆された。これらのことから,Zbed3はSCMCの構成成分である可能性が考えられた。次に,生体内での機能を調べるために,Zbed3のノックアウトマウスを作製した。その結果,メスのZbed3ノックアウトマウスから得られた受精卵では胚盤胞期への発生率が著しく低下すること,また多くの受精卵から不均等な割球を持つ2細胞期が得られることが明らかとなった。以上から,Zbed3は初期発生に必須の母性効果遺伝子であり,均等な割球を持つ2細胞期胚への分裂に重要な役割を果たすことが示唆された。</p>

著者

三浦 瑠璃 江村 菜津子 齋藤 ゆり子 澤井 健

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.112, pp.P-42-P-42, 2019

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<p>【目的】哺乳動物の初期胚は,桑実期から胚盤胞(BC)期にかけて,内部細胞塊(ICM)と栄養膜細胞(TE)への分化が起こる。SOX2はICM分化に重要な役割を担うと考えられているが,ブタ初期胚におけるSOX2発現動態と胚発生への役割については明らかではない。本研究では,ブタ胚におけるSOX2発現動態とその発現抑制が初期胚発生におよぼす影響について検討した。【方法】ブタIVM卵子および1-細胞期からBC期における<i>SOX2</i> mRNA発現量およびSOX2タンパク質の発現を解析した。次に,ブタ1-細胞期胚にSOX2発現抑制用siRNAを注入する区(SOX2 siRNA 区),Control siRNAを注入する区(Control siRNA 区),siRNAを注入しない区(無処理区)を設け,BC期までの発生率を調べ,BC期での<i>TEAD4</i>および<i>OCT-4</i> mRNA発現量を解析した。また,それら BC期胚の総細胞数およびSOX2発現陽性細胞率を調べた。【結果および考察】<i>SOX2 </i>mRNA発現量は,IVM卵子,1-細胞期,桑実期,BC期に比べ,8-~16-細胞期で有意(<i>P</i> < 0.05)に高い値を示した。SOX2タンパク質は8-細胞期以降の細胞核で発現が認められ,BC期胚においては,ICMと思われる部位に局在が認められた。Control siRNA区およびSOX2 siRNA区の4-細胞期以上への発生率は,無処理区と比較して有意(<i>P </i>< 0.05)に低い値を示したが,BC期への発生率は各処理区間に差は認められなかった。<i>TEAD4</i>および<i>OCT-4</i>発現量は,各処理区間に差は認められなかった。BC期での総細胞数およびSOX2発現陽性細胞率は無処理区に比べ,SOX2 siRNA区で有意(<i>P </i>< 0.05)に低い値を示した。SOX2 siRNA区においてはBC期ICMへのSOX2局在化が認められなかった。本結果より,SOX2はブタ初期胚におけるICM形成に関与する可能性が示された。</p>

著者

八木 千尋 北山 みずほ 坂本 信介 篠原 明男 枝重 圭祐 越本 知大

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.106, pp.P-39-P-39, 2013

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<b>【目的】</b>宮崎大学フロンティア科学実験総合センターではマウス(<i>Mus</i>属)やラット(<i>Rattus</i>属)とは異なる分類群である<i>Apodemus</i>属の1種,ヨーロッパモリネズミ(<i>Apodemus sylvaticus</i>)を飼育維持している。本種は高脂血症を自然発症し,さらには高コレステロール飼料給与によりアテローム性動脈硬化が誘導される個体や,Ⅱ型糖尿病様の病態を呈する個体が存在することから新たな病態モデル動物候補として特性評価研究を進めている。本研究では自然交配により維持している本種のコロニーを効率的に管理するために必要な,卵子および胚の凍結保存法開発に向けた知見の集積を目的として,卵子および2細胞期胚の水と耐凍剤の膜透過性を評価することによって凍結保存の可能性を検討した。<b>【材料・方法】</b>排卵誘起処理後M-II期卵子と,雄との自然交配を経て得た2細胞期胚を回収し,15℃および25℃でスクロースおよび5種類の耐凍剤(グリセロール,DMSO,エチレングリコール,プロピレングリコール,アセトアミド)添加PB1液に曝露し,経時的な相対体積変化から水透過性(μm/min/atm:Lp)および耐凍剤透過性(×10^–3cm/min:Ps)を算出した。<b>【結果・考察】</b>25℃での卵子および2細胞期胚のLpは,15℃の値よりも2倍以上高かった。 また卵子および2細胞期胚のPsは,グリセロールで0.01~0.05と非常に低く,その他の耐凍剤で0.23~2.26を示し,また15℃よりも25℃で高い値を示した。このことから水と耐凍剤は温度依存的に膜を透過していると考えられた。これらの結果は,マウスで報告されている値と非常に近似しているため,本種における卵子および2細胞期胚の凍結保存法はマウスと同様の手法が適用できる可能性がある。今後はさらに発生の進んだ胚のLpおよびPsを測定するとともに,これらの凍結保存を試みたい。

著者

齋藤 ゆり子 江村 菜津子 三浦 瑠璃 澤井 健

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.112, pp.P-48-P-48, 2019

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<p>【目的】microRNA(miRNA)はmRNAの翻訳抑制に関与する短鎖ノンコーディングRNAである。我々は,前回の本大会において,miRNA合成関連因子である<i>DROSHA</i>の発現を抑制すると,ブタ初期胚における16-細胞期以降の発生率が低下することを明らかにした。本実験では,<i>DROSHA</i>発現抑制がブタ初期胚の遺伝子発現に及ぼす影響を検討するとともに,それら遺伝子の発現に関与するmiRNAのブタ初期胚での発現動態を調べた。【方法】ブタ1-細胞期胚に,<i>DROSHA</i>発現抑制用siRNAを注入する区(DROSHA siRNA区),いずれの遺伝子の発現も抑制しないControl siRNAを注入する区(Control siRNA区),siRNAを注入しない区(無処理区)を設け,得られた8-細胞期胚における<i>KLF4</i>,<i>DNMT3A</i>および<i>RBL2</i>のmRNA発現量を解析した。次に,<i>KLF4</i>もしくは<i>DNMT3A</i>遺伝子発現を制御することが示唆されているmiR-29b,miR-145および,miR-371について,体外成熟(IVM)後のブタ卵子,1-細胞期から胚盤胞(BC)期のブタ胚における発現量を解析した。【結果および考察】<i>KLF4</i>および<i>DNMT3A</i>発現量は,無処理区に比べDROSHA siRNA区で有意(P<0.05)に低い値を示した。一方,<i>RBL2</i>発現量は各処理区間に差は認められなかった。miR-29b発現量は,IVM卵子からBC期胚のいずれにおいても差は認められなかった。miR-145発現量は,IVM卵子,1-細胞期胚およびBC期胚と比べ,16-細胞期胚において有意(P<0.05)に高い値を示した。miR-371発現量は,IVM卵子および1-細胞期から16-細胞期胚と比べ,桑実期およびBC期で有意(P<0.05)に高い値を示し,また,桑実期胚と比較してBC期胚において有意(P<0.05)に高い値を示した。以上の結果より,初期発生過程で合成されるmiRNAがブタ胚の遺伝子発現を制御する可能性が示された。</p>

著者

皆川 修人 櫻井 伸行 高橋 一生 江村 菜津子 東間 千芽 橋爪 力 澤井 健

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.109, pp.P-93-P-93, 2016

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<p>【目的】miRNAの生合成を抑制したマウス胚では胚性致死となることから,miRNAを介した遺伝子発現制御が初期胚発生において重要な役割を担うと考えられる。miRNA-34cは,マウス胚において1-細胞期から発現量が上昇し,その機能を阻害すると卵割が停止する。またmiR-93およびmiR-34aはマウス胚性幹細胞および人工多能性幹細胞においてSox2や,Nanogの発現を制御している。しかし,ブタ胚においては上記miRNAの発現動態およびその機能は不明である。そこで本研究ではブタ初期胚における上記3つのmiRNAの発現動態とmiR-34cが初期胚発生に及ぼす影響について検討した。【方法】ブタ卵子(M-Ⅱ期)およびブタ体外受精(IVF)胚の1-細胞期,2~4-細胞期,8~16-細胞期,桑実期および胚盤胞期でのmiR-34a,miR-34cおよびmiR-93の発現量を解析した(実験1)。またmiR-34cに結合し,その機能を阻害するmiR-34c inhibitorを1-細胞期胚に注入し,その後6日間体外発生させ,胚盤胞期までの発生率を検討した(実験2)。処理区は,miR-34c inhibitor区および特定のmiRNAの機能阻害効果も持たないNon-effect inhibitor区とした。【結果および考察】実験1において,3種のmiRNAはいずれも全発生ステージで発現が確認された。miR-34cおよびmiR-93については各発生ステージにおいて有意な差は認められなかった。miR-34aについては桑実期および胚盤胞期において,発現量が他の発生ステージよりも有意(P<0.01)に高い値を示した。実験2おいて,miR-34c inhibitor区およびNon-effect inhibitor区で発生率に有意な差は認められなかった。本研究の結果より,ブタ初期胚における3種のmiRNAの発現動態が明らかとなった。マウス胚においてmiR-34cは受精後の1細胞期から発現量が上昇するが,ブタ胚においては受精以前のM-Ⅱ期から発現が認められた。またmiR-34cに関しては,その機能阻害が胚発生に影響をおよぼさなかったことから,初期胚発生におけるmiR-34cの機能は動物種によって異なることが示唆された。</p>

著者

櫻井 伸行 高橋 一生 江村 菜津子 皆川 修人 東間 千芽 橋爪 力 澤井 健

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.109, pp.P-92-P-92, 2016

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<p>【目的】マウス胚において,内部細胞塊から胚盤葉上層(EPI)および原始内胚葉(PrE)への分化はFGFシグナルによって制御されている。FGFシグナルのリガンドであるFgf4はEPI前駆細胞から分泌され,隣接する細胞に作用することでPrE分化を促す。そのため,<i>Fgf4</i>欠損マウス胚はPrE分化に異常をきたし,胚性致死となる。一方,ウシ胚の発生および組織分化におけるFGFシグナルの役割は明らかでない。本研究では,ウシ胚の各発生ステージにおける<i>FGF4</i> mRNAの発現動態解析およびウシ初期胚に対するFGF4発現抑制実験を行い,ウシ胚の発生および組織分化におけるFGF4の役割について検討した。【方法】食肉処理場由来のウシ卵巣から卵丘細胞–卵子複合体を吸引採取し,体外成熟培養後に媒精を行うことで体外受精胚を得た。各発生ステージにおいてサンプリングを行い,<i>FGF4</i>の遺伝子発現量解析を行った。1細胞期胚の細胞質にFGF4発現抑制用のsiRNAを注入し,胚発生への影響を検討した。実験区はFGF4発現抑制区に加え,遺伝子発現抑制効果を有しないControl siRNA注入区および注入操作を行わないUninjected区を設けた。桑実胚を対象として,EPIの分子マーカーである<i>NANOG</i>およびPrEの分子マーカーである<i>GATA6</i>について遺伝子発現量解析を行った。【結果および考察】<i>FGF4</i>発現は16細胞期までは認められず,桑実期以降でのみ認められた。培養7日目における胚盤胞期への発生率は,Uninjected区(64.6%)およびControl siRNA区(60.1%)と比較してFGF4発現抑制区(20.6%)において有意(<i>P</i> < 0.01)に低い値を示した。FGF4発現抑制区における<i>NANOG</i>発現量は,Control siRNA区と比較して有意(<i>P</i> < 0.05)に高く,また<i>GATA6</i>発現量はUninjected区と比較して有意(<i>P</i> < 0.05)に低い値を示した。本研究では,ウシ胚の初期発生においてFGF4が重要な因子であることが明らかとなり,またウシ胚においてもFGFシグナルがEPI/PrE分化を制御する可能性が示唆された。</p>

著者

神谷 拓磨 松橋 珠子 細井 美彦 松本 和也 宮本 圭 本上 遥 久米 健太 樋口 智香 奥野 智美 山本 真理 越智 浩介 井橋 俊哉 辻本 佳加理

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.111, pp.P-54-P-54, 2018

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<p>【目的】分化した体細胞核を未受精卵子内に移植することにより,リプログラミングが誘導され,クローン動物の作出が可能となる。未受精卵を用いてクローン胚を作成する場合,細胞分裂やDNA複製を経て,移植された体細胞核から胚性遺伝子が発現を開始するため,細胞分裂やDNA複製は転写のリプログラミングに不可欠な要素の一つと考えられてきた。そこで本研究では,転写リプログラミングにおける細胞分裂やDNA複製の寄与を明らかにするため,マウス初期胚を用いて細胞分裂及びDNA複製非依存的に体細胞核の転写リプログラミングを誘導する核移植法の開発を目指す。【方法】C57BL/6雌マウスとDBA/2雄マウスを用いてIVFを行い,その後mKSOM培地で4細胞期胚まで培養した。4細胞期胚をDemecolcine添加培地に移し,細胞周期をG2/M期に停止した。G2/M期停止4細胞期胚にTransgeneによりトレース可能な細胞株を移植し,24時間後に免疫染色を行い,共焦点顕微鏡下で移植細胞核の構造的な変化を観察した。また,G2/M期停止4細胞期胚にC2C12筋芽細胞を核移植し,α-amanitinによって転写を阻害した区と非添加区に分け24時間培養後,RNA-seqによって遺伝子発現を調べた。【結果】免疫染色の結果,移植した細胞核が24時間以内に急速なリモデリングを受け,胚由来の核と似た構造を示すことが分かった。移植核中には2番目のセリンがリン酸化を受けたRNA PolIIが確認され,移植後の細胞核は転写活性を有することが分かった。次にRNA-seqの結果,初期胚で高発現する遺伝子の多くが核移植した4細胞期胚から新たに転写されることが分かった。さらに,Utf1やEsrrbなど4細胞期からES細胞にかけて発現の高い遺伝子の転写も確認した。以上の結果より,マウス4細胞期胚を用いた新規核移植法を示した。また,本実験で発展した核移植法により,細胞分裂及びDNA複製非依存的に体細胞核の転写リプログラミングが誘導できる可能性が示唆された。</p>

著者

山口 正義 谷 哲弥 加藤 容子

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.108, pp.P-92-P-92, 2015

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【目的】哺乳動物では,個体が老化するにつれて生殖能力が低下する。すなわち,雌では,個体の老化に伴い卵子の老化も生じているためである。卵子の老化には,核(染色体)と細胞質中因子の両者に生じる様々な変異が含まれており,一度生じた卵子の老化を消去することは困難で,老齢個体から採取した卵子を若返らすことは容易にはできない。一方,近年,母体の栄養状態や給餌内容(栄養素)が,母体の生殖能力に影響を及ぼすことが相次いで発表されている。そこで,本研究では,老齢マウスの生殖能力を経時的に検討するとともに,給餌内容が母体の老化に影響を及ぼすかどうか予備的に検討したので報告する。 【方法】実験1)ICR系マウスを用い,通常の方法で飼育した6週齢(若齢),12~13週齢(適齢),38~50週齢(老齢)雌マウスを用い,雄マウスとの自然交配率,過剰排卵処理に対する感受性や採卵数,得られた卵子の体外発生能,また,臓器の重量計測等を行った。実験2)給餌内容が母体の生殖能力に影響を及ぼすかについて,抗酸化作用等がありヒトの健康に良いとされる4種類の農産品乾物を加えた飼料を与え,老齢まで飼育し,添加物が母体や卵子の老化に影響を与えるかどうかを予備的に検討した。 【結果】実験1)老齢マウスでは,他の2区と比較して,自然交配率が極めて低く,採卵数も極めて少なかった。しかしながら,得られた卵子については,単為発生刺激後,胚盤胞まで発生することが分かった。 実験2)添加物を給餌するために,飼料の形態を検討した結果,粉末飼料を与えることが適切であることが分かった。飼料添加物としては,まずは既報を参考に,ゴマ,キナコ,日本茶,クズを検討した。現在,経時的に観察,ならびに,給与した個体や卵子の生殖能力について検討中である。

著者

吉田 真弓 濱野 光市 辻井 弘忠

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.98, pp.145, 2005

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【目的】リラキシンはペプチドホルモンの一種であり、分娩時の恥骨間靱帯の伸長や産道拡大などの働きを持つ。その一方で、脳や雄性生殖器にも受容体が存在することが報告されており、多機能なホルモンであることが分かっている。スナネズミは、癲癇や脳虚血等の疾患モデル動物として有用な実験動物であるが、近年LHやFSHの配列が決定されたところであり、生理学分野における研究の歴史は浅い。そこで本研究では、スナネズミにおけるリラキシン研究の導入とするべく、スナネズミのリラキシン塩基配列を決定し、既に配列の分かっているマウス・ブタ・ヒトなどを対照とし、塩基・アミノ酸配列の比較を行った。【方法】妊娠15,19,23日目のメススナネズミから卵巣・胎盤・子宮・脳を採取し、LN<SUB>2</SUB>で急速に凍結した。サンプルからISOGENを用いてTotal RNAを抽出した。RT-PCRを行いFirst strand cDNAを作成した。ハムスターリラキシンから構築したプライマーを元にPCRを行った。cDNAのプールの評価のために、G3PDHプライマーを用いた。PCR産物はアガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンドからPCR産物の抽出を行ったのちシークエンスを行い、配列決定をした。【結果】全ての実験区に於いて、First strand cDNAがもたらされたが、そのうち、メススナネズミの卵巣由来のcDNAからリラキシンのB-chainを含む塩基配列が増幅され、この塩基配列を決定することが出来た。また、この塩基配列及びそれから推定されたアミノ酸配列は特にハムスターのものと高い相同性を示した。

著者

川手 憲俊 吉川 裕亮 辻 誠 稲葉 俊夫 喜田 加世子 玉田 尋通 澤田 勉

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.99, pp.102, 2006

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【目的】黄体形成ホルモン(LH)のレセプターは精巣や卵巣の細胞膜上に存在し、LHによるステロイドホルモン分泌の刺激を伝達する。同レセプターの遺伝子は、多くの動物種でクローニングされているが、イヌの性腺組織から完全長cDNAをクローニングした報告は見当たらない。そこで本研究では、イヌ精巣組織からLHレセプターcDNAのクローニングを行い、塩基配列を解析した。【方法】健常な成犬(グレートデンおよびポメラニアン種)の精巣からtotal RNAを抽出した。全長cDNAを5つの断片に分けて、クローニングを行った。5'側の断片1を除く4つの断片については、それぞれに上流と下流プライマーを作成して、RT-PCR法により各cDNAを増幅した。断片1については、5'RACE法を用いてクローニングを試みた。得られたPCR産物は塩基配列決定用ベクターに組み込み、塩基配列を解析した。【結果】イヌの精巣由来RNAから、LHレセプターcDNAの5'側の断片1を除く2123bpをクローニングした。今回クローニングした2123bpのLHレセプターcDNAについて、グレートデンとポメラニアンとの間に、塩基配列で99.9%、アミノ酸配列で100%の相同性がみられた。また、イヌの同レセプターcDNAの終止コドンまでの塩基配列は、ブタ、ウシおよびヒトとの間にそれぞれ91.9%、91.7%および90.3%の相同性がみられた。イヌの同レセプターのアミノ酸配列は、ブタ、ウシおよびヒトとの間にそれぞれ92.4%、92.3%および89.1%の相同性がみられた。今回増幅した断片2(レセプターの細胞外領域に相当する)において75塩基(アミノ酸にして25個)の欠失したスプライスバリアントを見い出した。【結論】イヌの精巣由来RNAから、5'側の一部を除くLHレセプターcDNA(2123bp)をクローニングできた。イヌ精巣のLHレセプターmRNAにおいて、他の動物種では報告されていない新しい種類のスプライスバリアントの存在が明らかとなった。

著者

檜垣 彰吾 岸 昌生 永野 昌志 片桐 成二 高橋 芳幸

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.100, pp.20113, 2007

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【目的】マウス未成熟卵子の体外成熟培養時の気相中の酸素濃度および培養時間は研究者間で様々であるにも拘らず、それらが卵子の成熟にどのように影響するかを調べた研究は限られている。そこで、本研究では、成熟培養時の気相中酸素濃度と培養時間が卵子の核成熟動態および胚盤胞への発生能にどのように影響するかを検討した。【方法】供試卵子はICRマウスにウマ絨毛性性腺刺激ホルモンを投与して48時間後に胞状卵胞より採取した。成熟培養は5%ウシ胎子血清、0.23 mMピルビン酸、1 IU/mlブタ卵胞刺激ホルモン、10 ng/mlヒト組み換え上皮増殖因子および、50 &mu;g/mlゲンタマイシン添加したWaymouth's培地に用いて5あるいは20%の酸素を含む気相下で行った。実験1では0-15時間の成熟培養後に核相の判定を行った。実験2では10-17時間の成熟培養を行った卵子を体外受精(TYH培地、5時間、20%酸素下)および体外培養(KSOM培地、120時間、5%酸素下)に供試し、胚盤胞への発生率を調べた。【結果】5および20%酸素下で成熟培養した卵子の卵核胞崩壊は共に培養開始2時間後から見られ、それぞれ培養開始後15および4時間後までに全ての卵子で終了していた。また、第二減数分裂中期(MII期)卵子の出現は共に培養開始7時間後から見られ、その8および3時間後にMII率はプラトーに達した。以上の結果より5%酸素下では20%酸素下に比べて核成熟の進行が同調していないことが示唆された。胚盤胞への発生率は成熟培養時の酸素濃度の影響は認められなかったが、培養時間によって差が見られた。すなわち、両酸素濃度下で10時間培養群(10%)に比べ、12-17時間培養群(30-45%)では有意に高く、12-17時間の成熟培養群間には有意な差は認められなかった。以上の結果より、卵子が十分な胚盤胞への発生能を獲得するためには成熟培養時の酸素濃度に拘らず12時間以上の培養時間が必要なことが示唆された。

著者

中井 美智子 ソムファイ タマス 伊藤 潤哉 谷原 史倫 野口 純子 金子 浩之 永井 卓 柏崎 直巳 菊地 和弘

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.105, 2012

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【背景】ブタを含む家畜ICSI卵では,受精卵や胚の作出効率が低いことが問題となっている。これは,通常の受精時に生じるとされる一過性の卵細胞質内Ca²⁺濃度([Ca²⁺]i)上昇の反復変動パターンがICSI卵では再現できないことに起因する可能性が考えられてきた。しかし,実際のブタICSI卵における[Ca²⁺]i変動パターンは明らかにされていない。本研究では,ブタICSI卵とIVF卵における[Ca²⁺]i変動パターンの比較および受精に及ぼす影響を調べた。【方法】ブタ体外成熟卵と凍結融解精巣上体精子を実験に供した。IVFでは単精子(IVF-mono)と多精子(IVF-poly)侵入卵,ICSIでは電気刺激処理(ICSI-acti),無処理(ICSI-nonacti)卵を作成した。実験1:IVF-mono,ICSI-acti,ICSI-nonacti区卵をCa²⁺指示薬であるFura2に37&deg;C,15分間感作させた後,レシオイメージングシステム(浜松ホトニクス)を用いて測定を4時間行い[Ca²⁺]i変動パターンを比較した。実験2:IVF‐mono,ICSI‐actiおよびICSI-nonacti区での正常受精率(2極体+2前核/精子侵入卵)を調べた。【結果】実験1:IVF-mono区における[Ca²⁺]i変動は少なく,ICSI-actiおよびICSI-nonacti区でも同様なパターンが観察された。実験2:正常受精率は,ICSI-acti区(67.3 &plusmn; 9.3%)とICSI-nonacti区(48.8 &plusmn; 13.7%)の間に有意差はなく,両区ともにIVF-mono区(100%)より有意に低かった(P < 0.05, ANOVA/Tukey)。【考察】IVF-mono卵で生じる[Ca²⁺]i変動は予想外に低頻度であり,電気刺激の有無にかかわらずICSI卵における[Ca²⁺]i変動パターンと同様であることが明らかとなった。また,ICSI卵における正常受精率はIVF卵に比べ低いため,その要因が[Ca²⁺]i変動パターン自体の違いではないことが示唆された。

著者

若山 照彦 幸田 尚 小保方 晴子 野老 美紀子 リ チョン 寺下 愉加里 水谷 英二 グェン ヴァン トン 岸上 哲士 若山 清香 石野 史敏

出版者

日本繁殖生物学会

雑誌

日本繁殖生物学会 講演要旨集

巻号頁・発行日

vol.106, pp.P-102-P-102, 2013

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【目的】哺乳動物のクローン作出は,優良家畜の大規模な生産や絶滅危惧種の保全を可能にする新しい技術として期待されてる。しかし現在の成功率では一度に大量のクローン動物を作ることは出来ないため,クローン動物の体細胞から再びクローン動物を作り出す連続核移植(再クローニング)技術が必要だと考えられていた。ところがこれまでの報告では,再クローニングを繰り返すごとに出産率は低下し,マウスで6世代,ウシやネコで2世代までが限界だった。この原因は,クローン技術特有の「初期化異常」が,核移植を行うたびに蓄積するためと考えられていたが,成功率が低すぎるため検証できていなかった。そこで今回我々は,最新の技術を用いて再クローニングに限界があるのか確かめてみた。 【方法】我々は2005年にトリコスタチン A(TSA)が初期化を促進し,クローンマウスの出産率を大きく改善できることを発見した。そこでTSAを用いて1匹のドナーマウス(BD129F1)からクローンマウスを作り(G1と呼ぶ),このクローンマウスが3カ月齢になった段階で再びクローンマウスを作製した(これをG2と呼ぶ)。以降これを繰り返した。生まれた再クローンマウスについて,テロメアや妊性,網羅的遺伝子発現などを調べ,自然マウスおよびG1クローンマウスと比較し,エピジェネティック異常が蓄積されるか調べた。 【結果】現時点で27世代,合計645匹のクローンを作ることに成功している。核移植の出産率は1世代目の7%から上昇傾向を示し,最高で15%を記録している。G20クローンの繁殖能力,寿命,テロメアの長さなどに異常は見られなかった。また網羅的遺伝子発現解析により核移植を繰り返しても初期化異常は蓄積しないことが明らかとなった。これらの結果は,再クローニングはほぼ無限に繰り返せることを示している。Wakayama et al., Cell Stem Cell 2013.