2 0 0 0 腸管出血性大腸菌に対するワクチンの開発研究
腸管出血性大腸菌は、ヒトだけではなく家畜からも多数分離されており、ウシやブタの腸管出血性大腸菌感染症は畜産業界では大きな問題となっている。本感染症の感染源は、主として食肉で感染した家畜の糞便中の腸管出血性大腸菌が何らかの経路でヒトへ感染すると考えられている。従って、家畜の腸管出血性大腸菌感染を予防できるワクチンの開発は畜産業界に有用であるばかりでなく、ヒトの腸管出血性大腸菌感染、それに引き続く出血性大腸炎や溶血性尿毒症症候群の予防にも有効である。本研究では、ブタの浮腫病の原因である腸管出血性大腸菌に対するワクチン株を構築し、その有効性を証明した。すなわち、浮腫病のブタから分離したベロ毒素(VT2eまたはVT2vp1)を産生する腸管出血性大腸菌について、抗原性は保有するが毒素活性の喪失した変異毒素を産生する変異株を作出した。まず、VT2vp1のAサブユニットN末端から167番目のグルタミン酸(E167)と170番目のアルギニン(R170)を、それぞれグルタミン(Q167)とロイシン(L170)に置換したVT2vp1変異毒素を産生するような遺伝子を作出した。この遺伝子と野生型の毒素遺伝子を相同組換えにより置き換え、変異株を作出した。この変異株は野生型の毒素と同様の抗原性は保持していたが、ベロ細胞を用いた試験により毒素活性が喪夫していた。また、この変異株の豚への毒力を野生株を対照にして調べた結果、病原性は喪失していた。この変異株をワクチン候補株として、感染防御能を調べたところ、変異株を投与した豚群(n=20)は浮腫病由来の野生株の投与に対して浮腫病の発症はみられなかったが、ワクチン株を投与しなかった豚群(n=20)では、12頭が浮腫病を発症し、死亡した。また、変異株投与豚において、血中IgG価および糞便中IgA価の上昇も確認された。
1 0 0 0 OA 炭疽菌の病原性について
1 0 0 0 羊スクレイピー病原体(プリオン)の多様性に関する研究
羊のスクレイピー、牛の海綿状脳症(BSE)、およびクロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)に代表される伝達性海綿状脳症(プリオン病)の病原体(プリオン)は病原体特異的な核酸を持たないことから、遺伝子型別および抗原型別は病原体型別には応用できない。しかしプリオンは生物学的性状あるいは生化学的性状によりある程度区別可能である。そこで本研究では、日本の羊スクレイピーの病原体に多様性("株")が存在するか否かを明らかにするための一連の実験を行なった。また、プリオンの多様性を規定するPrP以外の宿主の遺伝的要因についても検討を加えた。我が国で過去10年間に日本で発生した羊スクレイピーの11例を選抜し、マウスに接種して伝達性と羊脳内に蓄積したPrP^<Sc>の蛋白質分解処理抵抗性を調べた。その結果、使用した11例のスクレイピーは生物性状および生化学性状の異なる3群に分類された。つまり日本には複数のスクレイピー病原体が存在することが明らかとなった。本研究のような多数の羊スクレイピーを材料としてその性状を詳細に比較検討した研究はこれまでに英国で報告があるのみで、日本では本研究が初めての例である。本研究で得られた成績は、日本に存在するスクレイピー病原体が動物種を越えて牛や人間に感染する危険性を評価するための重要な知見となる。人ではアポリポプロテインE(ApoE)の特定の遺伝子型が、アルツハイマー病の危険因子であり、またCJDの病型に関与することが示唆されている。そこで本研究では、羊スクレイピーにおいてApoEが病型や病原体株の多様性に関与するか否かを検討した。まず羊ApoE遺伝子をクロ―ニングして塩基配列を決定した。次に羊ApoE遺伝子の多型を調べた結果、羊には3種のApoE遺伝子型があることが明らかとなったが、羊ApoE遺伝子の多型とスクレイピー病原体の生物性状および病型に関連は認められなかった。
1 0 0 0 赤痢菌の細胞侵入に関わるプラスミド遺伝子の構造と機能
近年分子生物学の進歩により病原細菌のビルレンスを支配する遺伝子を分子遺伝学的に解析し、発症の分子機構を素反応のレベルで解析し、その結果を総合的に一連の生化学的反応として理解することが可能になりつゝある。本研究は感染症の立場からのみならず、細胞侵入性、すなわち生きた菌が生きた上皮細胞(本来食作用をもたない)に侵入して増殖(一次細胞侵入性という)し、さらに隣接細胞に順次拡散(二次細胞侵入性という)していくという純生物学的にも極めて特異な発症機構を示す赤痢菌をとりあげ、その病理発生機構を分子レベルで理解しようというものである。細胞侵入性に関与する巨大プラスミドを分子遺伝学的に解析し、SalI制限酵素地図を作成し、その上の少くとも7ケ所のビルレンス関連領域を同定した。SalI断片G上には116KDの蛋白を支配するvirGシストロンが存在し、その産物の所在を決定し、それが二次細胞侵入性に必須であることを見出した。SalIーF断片上には30KDの蛋白を支配するATに富むvirFシストロンが存在し、本プラスミド上に存在する他のビルレンス関連遺伝子の発現を転写レベルでポジチブに制御している。連続したSalI4断片、BーPーHーD上には領域1から5と名づけた10数個のビルレンス関連遺伝子群があって、B端に存在するvirBシストロンは33KDの蛋白を支配し、その転写はvirFによってポジチブに調節されている。さらにvirBのコードする蛋白がipaB,ipaC,ipaDをはじめとし、領域2〜5に存在するビルレンス関連遺伝子群の転写をポジチブに調節していた。他方、染色体上に存在するビルレンス遺伝子の一つ、kcpAもクローン化し、蛋白産物を同定し、その役割を明らかにした。ミニセル法および塩基配列の決定によりこの領域には13KDの蛋白をコードする単一のシストロンkcpAが存在することが明らかになった。