1 0 0 0 SARSコロナウイルス細胞侵入の分子機構に関する研究
SARS-CoVは、受容体ACE2に結合後、エンドゾームに輸送され、cathepsin-Lなどのプロテアーゼによりスパイク(S)蛋白の膜融合能が活性化され、細胞侵入するという、エンドゾーム経路で細胞内へ侵入する。一方、我々は外来性のプロテアーゼが存在する場合、細胞表面から侵入する可能性を提唱した。この細胞表面からの侵入は、ACE2結合したS蛋白がプロテアーゼにより解裂され、膜融合活性を獲得するために可能になると考えられている。本研究では、この仮説を検証するため、解裂性S蛋白を持つpseudotypeウイルスを用いて、細胞表面からの侵入が可能か否かに付いて検討した。SARS-CoV S蛋白上の細胞内プロテアーゼ(フリン)により解裂が予想される3か所にプロテアーゼ認識アミノ酸配列を導入した変異S蛋白を作成した。このS蛋白をenvelope上に持つ水泡生口内炎ウイルス(VSV)のpseudotypeウイルスを作成し、その細胞侵入経路を検討した。3か所の変異挿入部位の中で、S蛋白797/798で解裂が起こるよう設計されたS蛋白は、細胞融合性を示し、pseudotype envelope上に発現された。このpseudotypeは、SARS-CoV非解裂性S蛋白を持つpseudotypeと比べ、エンドゾーム経由感染阻止薬による感染抑制はなく、また、SARS-CoVがエンドゾーム内で活性化されるプロテアーゼ阻害剤の影響も低かった。以上の結果から、解裂性S蛋白を持つpseudotypeは細胞表面から侵入することが強く示唆された。即ち、SARS-CoVはプロテアーゼの存在下で直接細胞膜から細胞侵入する能力を有することが確認された。マウス肝炎ウイルス(MHV)のS蛋白のheptad repeat由来peptideは膜融合活性を阻害することでウイルス感染を阻止することが報告されている。SARS-CoVのS蛋白でも同様の実験がなされたが、MHVに比べて阻害効率が著しく悪い事が報告されている。我々は、外来性のプロテアーゼ存在下、細胞表面からの感染が可能な状態で、peptideの感染阻害効率を再評価した。この結果、細胞表面からのウイルス感染では従来考えられていたよりも低濃度のpeptideで効率よく阻害できる事が分かった。このことは、これらのpeptideが潜在的なSARS-CoVに対するinhibitorとなりえる事を示唆するもので、SARS-CoVの感染経路にpeptideをターゲティングする事でSARS-CoVの感染を効率よく阻止できる可能性を示した。
- 著者
- 田口 文広 松山 州徳 氏家 誠
- 出版者
- 日本獣医生命科学大学
- 雑誌
- 特定領域研究
- 巻号頁・発行日
- 2009
SARSコロナウイルス(SARS-CoV)は細胞に感染する時、宿主細胞のプロテアーゼを利用することが知られている。細胞に吸着したウイルスにトリプシンなどのプロテアーゼが作用し、スパイク(S)蛋白が解裂されることにより、直接細胞膜から侵入する。また、プロテアーゼにより感染細胞は融合することも報告されている。プロテアーゼの非存在下では、エンドゾーム経由で感染するが、プロテアーゼ存在下と比べると、感染効率は低い。コロナウイルスの中ではSARS-CoVのみならず多くの種がプロテアーゼ依存性に感染し、細胞融合を引き起こす。その中でも、豚の下痢症ウイルス(PEDV)はプロテアーゼ依存性が高く、トリプシンなどのプロテアーゼが存在しないと感染拡大が極めて弱い。今年度は、PEDV感染におけるプロテアーゼの役割について検討した。トリプシン存在下或いは膜貫通型プロテアーゼTMPRSS2発現Vero細胞では、感染性ウイルス粒子が細胞外に効率よく放出され、プロテアーゼ非存在下と比べ、その感染性は100-1000倍高かった。我々は、トリプシン非存在下のVero細胞とプロテアーゼ阻害剤を加えたTMPRSS2発現細胞では、電子顕微鏡による観察で、ウイルス粒子が細胞表面に付着してクラスターを形成しているが、トリプシン付加により、また、プロテアーゼ阻害剤のないTMPRSS2発現細胞では、細胞表面のウイルス粒子のクラスターは消失していることを観察した。これらのことから、PEDV感染におけるプロテアーゼの役割は、細胞外へのウイルスの放出であり、それは、感染細胞外で細胞膜に付着しているウイルス粒子を細胞膜から剥がすのに重要であることが判明した。今後、どのような細胞分子がウイルスと細胞膜との結合に関与しているのかを検討したい。
1 0 0 0 新規αグリコシダーゼ阻害剤を用いた特異的抗コロナウイルス薬の開発
- 著者
- 氏家 誠 袴田 航
- 出版者
- 日本獣医生命科学大学
- 雑誌
- 基盤研究(C)
- 巻号頁・発行日
- 2016-04-01
小胞体αグルコシダーゼ阻害薬(AGI)は、宿主細胞のαグルコシダーゼの働きを抑制する事で糖蛋白質の合成を阻害する。このため、AGIは、コロナウイルス(CoV)を初めとするエンベロープウイルスに対して抗ウイルス活性を示す。我々は、これまでに、化合物ライブラリーからスクリーニングを行い、動物およびヒトCoVに対して強力な抗ウイルス活性を示す新規AGIを6種類同定した。AGIが示した抗CoV活性は、当初、構造蛋白質であるS糖蛋白質の合成阻害に起因すると考えられていた。ところが、AGIはCoVのS糖蛋白質だけではなく非糖蛋白質及びその転写活性をも選択的に阻害する事が示唆された。最終年度は、AGIが示したこの予想外の抗CoV機構の解明を試み以下の成果を得た。1)CoVは感染すると宿主細胞由来の脂質2重膜を変化させてDMVsと呼ばれる「CoV専用の複製工場」を形成する。このDMVs形成には、非構造蛋白質のNSP3、4及び6が関与する。NSP3及びNSP4は糖蛋白質であることから、AGIはこれら糖蛋白質に作用してDMVs形成を抑制すると仮定した。そこで、AGI存在及び非存在下、感染細胞のDMVs形成を観察したところ、AGI存在下ではDMVs形成が著しく抑制される事が分かった。2)次にAGI存在及び非存在下、NSP4糖蛋白質の合成量を比較したところ、AGI存在下ではNSP4合成が強く阻害される事が分かった。これらの結果から、AGIは非構造蛋白質のNSP4糖蛋白質の合成を阻害することでCoV専用の複製工場DMVs形成そのものの合成を抑制し、結果として、CoVの転写活性・翻訳活性を強力に阻害することで強い抗CoV活性を持つことが示唆された。今後は、AGIによる抗CoV機構のさらなる詳細な解析を行いたい。
1 0 0 0 OA エンベロープウイルスに対する抗ウイルスペプチド薬の新戦略
- 著者
- 氏家 誠
- 出版者
- 日本獣医生命科学大学
- 雑誌
- 若手研究(B)
- 巻号頁・発行日
- 2011
エンベロープウイルスの膜融合蛋白質のheptad-repeat(HR)領域を標的とした抗ウイルスペプチド薬(HRP)は、ウイルスの膜融合活性を阻害する事で、ウイルス感染を抑制する。しかしながら、HRPは、細胞表面から直接侵入するウイルス※には高い抗ウイルス活性を示すが、エンドソームには取り込まれにくいため、エンドサイトーシスで細胞に侵入するエンベロープウイルスにはほとんど効果がない。本研究では、HRPにコレステロール(Chol)を結合することでエンドソーム指向性に改変したHRPを作製し、細胞表面経路又はエンドサイトーシス経路で細胞侵入する各種コロナウイルス(CoV)を用いて抗ウイルス活性を評価した。この結果、HRP-cholは、CoVの細胞表面経路だけでなくエンドサイトーシス経路も効率良く阻止する事を明らかにした。これらの結果から、エンドサイトーシス経路を主な細胞侵入経路とするその他のエンベロープウイルス(インフルエンザウイルス・エボラウイルス等)にも、HRP-cholが応用可能であることが示唆された。※最近の研究では、これまで細胞表面で膜融合を起こし細胞表面から侵入すると考えられてきたHIVやRSVなども、エンドサイトーシスを利用して感染する事が報告されている。ここでは、従来の「エンドサイトーシス侵入経路」と区別するためこれらの細胞侵入方法を「細胞表面侵入経路」とした。
1 0 0 0 SARSおよび動物コロナウイルスの増殖と遺伝子発現に関する研究
1)SARSコロナウイルス(SARS-CoV)に関する研究SARS-CoVは通常エンドゾーム経由で細胞内へ侵入することが報告されているが、我々はSARS-CoVのS蛋白の融合活性を誘導するプロテアーゼ(trypsin, elastase等)存在下では細胞膜径路で侵入することを明らかにした。更に、この径路による感染は、エンドゾーム径路感染より100-1000倍感染効率が高いことが判明した(PNAS,2005に発表)。SARSの重症肺炎の発症機序は、ウイルス感染を増強する様なプロテアーゼの存在が重要ではないかと考え、マウスに非病原性細菌感染で肺elastaseを誘導し、SARS-CoVを感染させることにより、ウイルス増殖及び肺の組織障害が高くなることを観察した。今後、更に重症肺炎に至るウイルス側及び宿主側因子の同定を進めたい。2)マウスコロナウイルス(MHV)に関する研究神経病原性の高いMHV-JHM株は受容体発現細胞に感染し、その細胞から受容体を持たない細胞に感染することが知られている。我々は、JHM株を直接受容体非発現細胞へ吸着させることにより、感染が成立することをspinoculation法(ウイルスが接種された細胞をウイルスと共に3000rpmで2時間遠心)により証明した。また、受容体非依存性感染にはJHM株のS蛋白の自然条件下で融合能が活性化されるという性質によることも明らかにされた(J.Viro1.2006発表)。