1 0 0 0 OA 細胞シート工学を用いた組織再構築および再生医療への応用
- 著者
- 原口 裕次 清水 達也 大和 雅之 菊池 明彦 岡野 光夫
- 出版者
- 日本再生歯科医学会
- 雑誌
- 日本再生歯科医学会誌 (ISSN:13489615)
- 巻号頁・発行日
- vol.2, no.2, pp.83-92, 2004-12-30
- 被引用文献数
- 3
最近,欠損または機能不全に陥った組織・臓器に対する新たな治療法として細胞を用いた再生医療が注目され,すでにいくつかの治療法が臨床応用されている.また歯学分野においても幹細胞を用いた細胞移植により歯周組織の再生を目指した研究などが行われている.再生医療には細胞を注射針で不全部に注入する細胞移植療法と細胞から組織を再構築した後,移植する組織工学(Tissue engineering)的手法がある.後者は生命医科学分野だけでは実現が困難であった研究領域であり理工学的な技術との連携により急速に進歩しつつある.当研究所では,独自に開発したユニークな組織工学的手法「細胞シート工学(Cell sheet engineering)」を用い,種々の組織の再構築および再生医療への応用を目指し研究を行っており,一部の組織においてはすでに臨床応用もされ画期的な治療効果を得ている.
1 0 0 0 OA 生体ナノ空間としての基底膜による細胞剥離機能に関するナノバイオテクノロジー
本研究では、温度変化に応答して水溶性を大きく変化させる温度応答性高分子のポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)(PIPAAm)とその誘導体で修飾した温度応答性パターン化表面を、電子線重合法を用いて作製し、これら表面の物性解析と異なる細胞種を用いた共培養、ならびに共培養細胞シートの作製への応用可能性を追究した。今年度は、パターンサイズの異なるパターン化温度応答性表面を作製した。具体的には、電子線重合法によりPIPAAmであらかじめ修飾された表面に、疎水性モノマーのブチルメタクリレート(BMA)溶液を塗布、パターンサイズの異なるマスクを介して電子線照射し、パターン化温度応答性表面を調製した。このとき、パターンサイズが100μm程度では、照射電子線の潜り込み等によりパターンサイズがマスクに比して変化する可能性が示唆された。この手法で、温度制御により部位特異的に親水性/疎水性(細胞非接着性/接着性)を制御しうる表面が調製できた。これらの表面を用い、肝実質細胞と、血管内皮細胞のパターン化共培養系を構築した。さらに、培養皿表面全体が親水性を示す20℃ですべての細胞を、パターン化形状を維持したまま1枚のシートとして回収できた。次に、共培養による肝実質細胞機能の変化をみるために、肝実質細胞から産生されるアルブミンの定量、ならびにアンモニア代謝に伴う尿素合成能を解析した。パターン化共培養により、いずれの機能も肝実質細胞単独培養系に比して高い数値を示した。さらにパターンサイズが小さいほど機能亢進することが明らかとなった。このとき、より小さなパターン化共培養系で肝実質細胞の培養期間が延長できる点も明らかとなった。以上の結果は、肝実質細胞と内皮細胞シートとの重層化によって得られた知見とよく一致していたことから、細胞-細胞間の距離がきわめて重要な影響を与え、細胞機能の発現につながるものと考えられる。
ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)をポリスチレン表面にグラフトした温度応答性培養皿を利用した、細胞シート工学的手法をさらに発展させることを目的として、(1)種々の生理活性因子を温度応答性表面に固定化し、ウシ胎児血清(狂牛病等の異種感染を完全には否定できない)や患者自己血清(患者毎に生理活性が異なりうる)を必要としない温度応答性培養床を開発、さらに本技術を応用し(2)細胞増殖を加速化し、短期間で細胞シートを作成することにも成功した。具体的には、温度応答性培養皿表面に、生理活性物質が固定化可能な結合サイトを導入し、RGDのような生理活性ペプチドを導入することで無血清培養条件下での細胞シート回収に成功した。また、スペーサーを介してPHSRN(RDGのシナジー配列)とをRDGと共固定することで細胞接着性が向上し、共固定の細胞培養における有用性を明らかにした。(2)さらに、RGDとインスリンの共固定した表面で細胞培養を行うことで、液中にインスリンが存在するよりも、細胞増殖が加速され短期間に細胞シートが作製できることを明らかにした。生理活性物質の固定にはアビジン、ビオチンケミストリーの利用も有効であることを明らかにした。今後、既に臨床応用をおこなっている皮膚表皮細胞シート、角膜上皮細胞シートの他、臨床応用を目指している角膜内皮細胞シート、網膜色素上皮細胞シート、心筋細胞シート、肺胞細胞シート等、それぞれの細胞種に最適化した固定化する生理活性子の組み合わせ、各々の因子の濃度を検討中である。
本研究では、3T3フィーダーレイヤーを完全に代替することを目的として、上皮幹細胞を維持・増殖させるのに必要な生理活性因子を固定化し、なお温度に応答して細胞シートを脱着させる次世代型温度応答性培養皿の開発を目的としている。カルチャーインサートを用いた実験、および上皮幹細胞を播種するまでの時間を変え効果を比較する実験等の予備的検討から、3T3フィーダーレイヤー由来の生理活性因子の少なくとも一部として細胞外マトリックス構成分子が機能していることを明らかにした(論文投稿準備中)。次に、3T3フィーダーレイヤー由来生理活性因子の検索の際にポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして用いるマウス細胞株を決定するために、種々のマウス由来細胞株をフィーダーレイヤーとして用い、角膜上皮細胞のコロニー形成能、重層化を評価した。本方法で選択したポジティブコントロール、ネガティブコントロールの細胞株からmRNAを単離し、TaqMan PCRを用いた定量化により約30種の細胞外マトリックス遺伝子について網羅的検索を行い、3T3と比較した。この方法でフィーダーレイヤー活性に関与する可能性をもつ数種の遺伝子を同定することができた(論文投稿準備中)。現在、これらの遺伝子産物を培養系に添加する実験、およびこれらの特異的な抗体を培地に添加する阻害実験といった細胞生物学的手法により、それら候補分子の上皮幹細胞に対する生理活性を検討中である。また、培地に添加する方法以外に、カルボキシル基を導入した温度応答性培養皿表面に共有結合的に固定化する方法もあわせて検討している。すでに、RGDペプチドやインシュリンなど生理活性分子を固定化した温度応答性培養皿を利用して、血管内皮細胞の接着性や増殖性が亢進することを確認している。現在、上記候補分子を結合した培養皿上での上皮幹細胞培養条件について検討を進めている。
1 0 0 0 OA ソフトインターフェースの分子科学
- 著者
- 前田 瑞夫 高原 淳 高井 まどか 栗原 和枝 長崎 幸夫 三浦 佳子 菊池 明彦 松岡 秀樹 北野 博巳 佐藤 縁 熊木 治郎 山岡 哲二 宮原 裕二
- 出版者
- 独立行政法人理化学研究所
- 雑誌
- 新学術領域研究(研究領域提案型)
- 巻号頁・発行日
- 2008-11-13
本領域では、ソフト界面に関わる先導的研究や若手研究者による挑戦的研究を糾合・組織化することにより、ソフト界面が示す新奇現象を解明し、その特性を活かした新機能材料を創出することを目指して研究を進めてきた。その成果は年度ごとの成果報告書・公開シンポジウム等により積極的に発信してきたが、それだけでは領域の全体像が見えにくいのも事実である。この点を補うために領域横断的な共通課題について公開ワークショップを開催することで俯瞰的な見方からの成果発信に努めてきた。この度、5年間の研究を取りまとめることで、新しい学術領域の確立という観点から、研究成果の全体像の公開・普及と内外の関連研究者のより一層の交流ならびに若手研究者の育成に努めた。具体的には、最終報告会として7月に東京大学駒場キャンパスにて公開シンポジウムを開催し、また同時にニュースレター12号を発行し配布ならびにウェッブ公開することで、成果の普及、領域内外の研究者との交流に努めた。また年度末の3月には、領域内の研究発表会を開催し、本領域研究に参画した研究者の互いの交流や成果取り纏め、ならびに今後の活動に関する意見交換を行った。10月には領域代表者の前田が日本化学会にて、また11月には事務担当者の長崎が日本バイオマテリアル学会大会にて、本領域の成果をアピールする招待講演を行ったほか、各研究グループにおいては、各自アウトリーチ活動の継続による国民の理解深化に努めた。一方で、領域ホームページの継続運用により持続的に広報活動を行った。また日本MRSに「ソフトインターフェース研究会」の設置を申請し、今後の継続的発展のためのプラットフォームを構築した。さらには、ソフト界面に関する英文教科書の執筆・編集を引き続き進めている。