3 0 0 0 動物の伝達性海綿状脳症の分子病態
プリオン病について、プリオン蛋白(PrP)遺伝子の面から解析が進み、また動物モデルでも種々の新しい知見が蓄積した。主な成果は以下のとおりである。プリオン病の発病機構についてPrP遺伝子多型性の関与が分子遺伝学的解析およびマウスへの伝播実験から新しい知見が蓄積してきた。とくにコドン219での正常多型と孤発性CJD発病との関連は欧米人にはみられない日本人特有のものであることが明らかにされ、さらにコドン102と219の病態への関与が示された。また遺伝子多型および異常とマウス伝播の関連も整理されてきた。さらに人PrP遺伝子を過剰に発現するトランスジェニックマウスが作製され、正常マウスよりもきわめて高い感受性を示すことが確認された。一方、生化学的解析でCJD患者脳でのガングリオシド組成の特徴が整理された。スクレイピーに関してはPrP^<Sc>のproteinase K抵抗性とマウスでの潜伏期の長さとの関連が解析され、マウス継代によりブリオンの構造が凝集しやすくなることが示唆された。PrP遺伝子の機能に関連しては、プリオンレス神経細胞が樹立され、アポトーシスによる細胞死滅が明らかにされた。プリオン蛋白の構造変換のモデルとしては、大腸菌のRNase HIのプソイドモジュールについて二次構造転移と自己増殖が調べられ、αヘワックスからβシートへの変換が反応温度に依存していることが明らかにされた。海綿状脳症の病態解析のモデルとしては、遺伝性海綿状脳症ラットzitterについて病変形成に関わると考えられるzi遺伝子のコンジェニックラットが作られ、また、病変形成におけるフリーラジカルの関与が示された。ぺットおよび鳥類での自然発生海綿状脳症の検索の結果、老齢のトリで1例アミロイド様物質沈着病変がみいだされたがプリオン抗体とは反応せず、本病の存在の可能性は非常に低いものと推察された。
1 0 0 0 スローウイルス感染症
I.はじめに スローウイルス感染症または遅発性ウイルス感染症28)は,周知のようにアイスランドの獣医学者Sigurdsson44)により1954年に提唱された概念であるが,それ以前に北欧ではヒツジの慢性病が知られており,その1つのスクレピーscrapieについては実験的伝播も行われていた9).Sigurdssonの提唱した概念は,①数ヵ月から数年にわたる長期の無症状潜伏期間ののち,②徐々に発病し,③遷延性,進行性で,④予後が悪く,⑤感染が1種類の動物の,単一の臓器または組織に限定して起こることである.このうち⑤は彼自身予想していたように,その後の動物実験の結果からは削除するほうがよいと思われるが,自然感染においてはほぼ妥当する.このうち既知のウイルスによる神経系の遅発性感染として麻疹ウイルスによる亜急性硬化性全脳炎SSPE,パポーバウイルスによる進行性多発性白質脳症PML,アデノウイルス32型や風疹ウイルスによる亜急性脳炎が知られている.これらは個々のウイルスと宿主側の要因,特に免疫機構との組み合わせにより持続性感染persistent infectionの形をとることが多い. さらに全く原因不明の発病因子が徐々に増殖して発病する亜急性海綿状脳症の1群がある.その代表はクロイツフェルト・ヤコブ病(Creutzfeldt-Jakob病,CJDと略)であるが,動物への実験的感染とともに,人では臓器移植,手術,外傷などとの関連性が問題となっているので,以下この群を中心に述べる.
クロイツフェルト・ヤコブ病(以下CJDと略す)の感染因子として、プリオンが提唱されている。プリオンを構成する主な蛋白としてプリオン蛋白の存在が知られ、single copy geneによりコードされた蛋白であることが報告されている。プリオン蛋白遺伝子のノックアウトにてスクレピーに感染しなくなるという事実より異常プリオン蛋白そのものが感染因子である可能性が高くなった。我々は、この異常プリオン蛋白が感染初期から、マウスの脾臓やリンパ操置の濾胞樹状細胞(FDC)に沈着することを世界で初めて証明し、このFDCへの蓄積機序を検討した。まず感染因子の投与ルートによるるリンパ操置のFDCへの蓄積を検討すると、腹腔内または脳内投与とも、投与後100%FDCに異常プリオン蛋白が沈着し脳内にプリオン蛋白が蓄積する以前から検出可能であり、発症前にCJDが診断可能であることを明らかとした。また、ヒトからマウスへの初代接種実験ではFDCへの沈着がおこらず、また腹腔内投与のみではいまだ発症したマウスがなく、中枢神経組織外での種間バリヤー形成の一役をFDCがになっている可能性を指摘した。初年度でのSCIDマウスの結果と考えあわせると、末梢ルートによるCJDの感染には、まずFDCに異常プリオン蛋白が蓄積することが必要条件であり、もしFDCへの蓄積がみられないなら、CJDの発症もみられないという結論となった。一方、直接中枢神経系へ投与を行なうと、FDCに沈着がみられてもみられなくてもCJDは発症することが明らかとなった。
1 0 0 0 プリオン蛋白遺伝子領域におけるコンジェニックマウスの開発
1.昨年度の研究実績の概要で,それまでのラジオアイソトープを用いたドットハイブリダイゼーションから安全迅速な制限酵素の切断長による方法を開発し,マウスのプリオン蛋白遺伝子変異の診断技術が向上したこと,同時に,個体について診断に基づき実施した戻し交配が6世代まで進んだ後,繁殖が困難になったので4世代まで元に戻って行なったことを報告した。ところが,うまく繁殖できたものの,その中にPrn-P^aとPrn-P^bとのヘテロが生まれず,次の世代につなぐことができなかった。したがって,F1世代から交配をやり直しており,もう少し時間がかかりそうである。2.その代わり,プリオン接種後の潜伏期間,病理などの感受性がプリオン蛋白遺伝子変異以外の要素で変わることをSCIDマウスで発見した。そして,それがコンジェニックマウスと同様にプリオン病のモデル動物として重要であることがわかったのでその概要を報告する。(1)SCIDマウスではクロイッツフェルトヤコブ病病原体を脳内接種後,プリオン蛋白遺伝子型がPrn-P^aのマウスと同様に150日程度の潜伏期間で発症するが,脳内接種では600日経っても発症しなかった。(2)この原因として,SCIDマウスでは,脾臓やリンパ節の濾胞樹伏細胞に異常プリオン蛋白が沈着しないという特異的な反応があり,それが示唆された。(3)このことから,SCIDマウスは,プリオン病の発病のメカニズムを解析するうえでも重要なモデル動物となることが判明した。(4)今後も,プリオン蛋白遺伝子のコンジェニックとSCIDマウスを組み合わせて,プリオン病解明のモデル動物開発を推し進めていきたい。
1 0 0 0 老年痴呆の分子機構-研究の総括-
当研究班では脳老化に伴う神経変性とくにアルツハイマー型老年痴呆を中心課題としてとり挙げ、その発症機序を分子生物学的ならびに分子遺伝学的手法により追求した。まず神経系細胞の生存維持に直接関与する神経栄養因子に関しては神経成長因子(NGF)およびそのファミリー蛋白質であるBDNF,NT-3,4,5を中心に特異抗体の作成とそれによる鋭敏な測定方法の確立、受容体のTrkA,B,Cなどの核酸、蛋白レベルでの検索で成果を挙げた。さらに神経突起進展作用を持つ新しい細胞接着因子ギセリンを発見し、逆に成長を遅らす因子GIFについてそのcDNAのクローニングから発現状態までを明らかにした。アルツハイマー病の2大病変である老人斑と神経原線維変化(PHF)については、主な構成成分であるβ蛋白とタウ蛋白を中心に検討を進めた。β蛋白に関してはびまん性老人斑は1-42(43)ペプチドから成り、アミロイド芯と血管アミロイドは1-40ペプチドから成ることを発見した。タウ蛋白に関しては、そのリン酸化酵素TPKI,IIを抽出し,それがGSK3とCDK5であることをつきとめた。さらには基礎的な業績として神経細胞突起の構成と機能、とくに細胞内モーター分子についての広川らの業績は世界に誇るものである。アルツハイマー病の分子遺伝学上の重要点は第14,19,21染色体にある。第14染色体の異常は若年発症家系で問題となり、わが国の家系で14q24.3領域のS289からS53の間約8センチモルガンに絞り込んでいた。最近シエリントンらによりpresenilin I(S182)遺伝子が発見され、その変異が上記のわが国の家系でも検出された。第19染色体のアポリポ蛋白E4が、遅発性アルツハイマー病のみならず早発性の場合にも危険因子となることを、わが国の多数の症例から明らかにした。第21染色体ではダウン症関連遺伝子とともにAPP遺伝子があり、そのコドン717の点変異をわが国のアルツハイマー家系でも確認した。さらに第21染色体長腕部全域の物理地図を完成した大木らの業績は今後、学界への貢献度が大であろう。これらの研究成果を中心に、単行本として「アルツハイマー病の最先端」を羊土社より平成7年4月10日に発行し、また週刊「医学のあゆみ」の土曜特集号として平成7年8月5日号に「Alzheimer病-up date」を出版した。