9 0 0 0 OA フクラガエルが生殖行為に用いる「糊状物質」の特性と成分の解明および人工繁殖の試み
- 著者
- 倉林 敦 住田 正幸 広瀬 裕一 浮穴 和義 澤田 均 中澤 志織 逸見 敬太郎 ベンセス ミゲル マローン ジョン ミンター レスリー ド プリーツ ルイス
- 出版者
- 広島大学
- 雑誌
- 挑戦的萌芽研究
- 巻号頁・発行日
- 2014-04-01
フクラガエルが生殖時に用いる糊の物理的特性と化学成分、および糊候補遺伝子の探索を行った。本研究の結果、フクラガエル糊の接着強度は、およそ500g/cm2であり、その主要構成要素は蛋白質であることが分かった。さらに、糊物質候補は、他のカエルで報告されていた皮膚分泌物と似た3種の蛋白質と、1種の新規蛋白質があることが示唆された。また、アメフクラガエルについて、人工繁殖を試みた。その結果、Amphiplexと呼ばれるゴナドトロピン誘導ホルモン作動薬とドーパ混合ホルモン剤が、本種の排卵を促すことを明らかにし、世界で初めて飼育下での人工的な交尾の促進と、営巣・産卵までの観察に成功した。
7 0 0 0 OA ヘビからカエルへの遺伝子水平伝播:起源系統と発生地域の解明および媒介生物の特定
我々は、ヘビからカエルに水平伝播した奇妙なLINE転移因子(以降TE-X)を発見した。本研究ではこの水平伝播現象について、(1)水平伝播発生地域の解明、(2)水平伝播の系統学的起源、(3)ベクター生物の特定、を目的とした。世界各地からカエル類29科161種194サンプル、ヘビ類17科125種139サンプル、寄生虫類166サンプルを収集し、各サンプルのTE-XをPCRと次世代シークエンサーを用いて解析した。その結果、TE-Xの水平伝播は、世界各地で複数回生じており、特にマダガスカルでは様々な寄生虫に仲介されて、現在進行形で脊椎動物間TE-X水平伝播が生じている可能性が高いことを明らかにした。
フクラガエル属(Breviceps)は、皮膚から分泌する糊によって雌雄が体を接着して交尾する、奇妙な四足動物である。我々は、発見以来60年間謎のままであったフクラガエル糊について、その物理的特徴と、構成蛋白質、およびその候補遺伝子を明らかにしつつある。本研究では、アフリカにおいてフィールドワークを行い、生殖用の糊という形質の、起源・要因・過程など、適応進化の実体を生態学・系統学・分子遺伝学の側面から解明する。この過程で、生態学・形態学的解析、新種記載、人工繁殖研究などもあわせて実施し、謎の多いフクラガエルとその近縁属の自然史について新たな知見を加えることを目的としている。本年度は、11月に南アフリカの西ケープ州、および、東ケープ州においてフクラガエル類の観察、採取を行なった。西ケープ州では、ジャイアントフクラガエル・ローズフクラガエルに加え、昨年採取はできたものの、実験前に死亡したクロフクラガエルを採取した。さらに、ケープタウンから30 kmほどの地点で、ナマクワフクラガエルを採取した。本種の分布はケープタウンから300kmほど北からと考えられていたため、これは本種の新産地の発見となった。東ケープ州では、ヘイゲンフクラガエルの採取を試みたが、成功しなかった。また、北ケープ州に分布するサバクフクラガエルを現地共同研究者に採取していただき、実験に供した。各種の糊分泌物を採取し、その強度を測定した。その結果、上記のうち1種(特許申請の関係で公表しない)は、極めて接着力の強い糊を持ち、その接着力は、アロンアルファなどの市販の接着剤を上回ることさえあった。また、フクラガエルの糊の接着力は、1)体の体積(重量)に比例して強くなる、生息地の土壌の硬さに比例して強くなる、という2つの仮説があったが、本年の研究からはそのどちらの仮説も否定された。
2 0 0 0 OA コケ植物主要分類群の系統関係を明らかにするための葉緑体ゲノム系統学の展開
7種のセン類,2種のタイ類,1種のツノゴケ類を含む,10種類のコケ植物について,葉緑体ゲノムの全塩基配列を新たに決定した.これまで,セン類は,タイ類やツノゴケ類と比べ,葉緑体ゲノムの構造が大きく異なっていると考えられていたが,セン類の系統基部に位置する分類群では,タイ類やツノゴケ類と非常によく似た葉緑体ゲノム構造をもつことが分かった.進化を通じておきたいくつかの遺伝子の欠失イベントは,セン類の主要分類群の分岐順序を考える上で有効な系統マーカーとなることが示唆された。高等植物の葉緑体で知られる,線状ゲノム分子,多量体ゲノム分子がコケ植物にも存在することを初めて明らかにした.
本研究では、ヘビからカエルに水平伝播したLINEレトロトランスポゾン(ここではTE-X表記)について、(1)水平伝播時期と地域の解明、(2)水平伝播遺伝子の視覚化、(3)爬虫類・両生類以外のマダガスカル産脊椎動物にもTE-Xの水平伝播が生じているかの解明、(4)水平伝播を媒介した寄生虫・ウィルスの探索、(5)南アジア原産のブラーミニメクラヘビが、マダガスカルのヘビタイプのTE-Xを持っている理由の解明を目的としている。本年度は、(1)分岐年代推定と水平伝播発生地域の推定を行った。(2)シマヘビと、ネガティブコントロールのツメガエルに対して染色体FISHを行なったところ、前者では強いシグナルが出たが、後者ではシグナルが得られなかった。これにより、FISHによる染色体上のTE-X検出系が確立できた。(4)蛇の体組織からウィルス核酸抽出方の確立を試みた。現在までに行なった実験系では、ウィルス核酸よりも細菌由来核酸の出現率の方が高かった。(5)バングラデシュとスリランカにおいて、現地共同研究者により、メクラヘビの採取が進んでいる。現時点で、バングラデシュでは30個体、スリランカでは19個体のサンプルが得られている。さらに、インドでは、30個体以上のメクラヘビが収集され、そのうち1個体がブラーミニメクラヘビであったが、残りは別種のヘビであった。そのうち1種は、異種間交雑起源のブラーミニメクラヘビの父方系統に属する種である可能性が高いことが分かった。さらに、インドのブラーミニメクラヘビについては、Hi-Seq NGS によりシークエンスが行われ、130 Gbp のアウトプットが得られた。また沖縄産個体について、MinION NGSによるシークエンスを行い、40 Gbpのアウトプットを得た。南アジアにマダガスカルヘビタイプのTE-Xを運んだベクター蛇の可能性が高いスナヘビが収集できた。
1.ニホンアカガエルの灰色眼と黒色眼の2つの色彩突然変異を用いて、皮膚が透明で内臓が透けて見える透明ガエルを効率的に作製し、その遺伝様式を明らかにした。透明ガエルの作製には灰色眼♀×野生型(ヘテロ)♂の交配が最も効率的であった。また、透明ガエルの皮膚の微細構造を調べるため、真皮色素細胞を電子顕微鏡で観察した。その結果、野生型では黄色、虹色、黒色の色素細胞が層状に観察されたが、透明ガエルでは色素細胞の数が少なく、未熟な黄色素胞様の細胞だけが見られた。2.I-SceI を用いたツメガエルの遺伝子導入法をニホンアカガエルに適用するため、顕微注入法の条件検討を行った。インジェクション効率および遺伝子導入効率の評価には赤色蛍光タンパク質mCherry mRNAとEF1αプロモーター連結EGFP/I-SceIベクターを用いた。その結果、受精卵に顕微注入した2日後に mCherry を発現した胞胚が得られた。3.透明ガエルについて色素細胞の変異をもたらす責任遺伝子を同定するため、次世代シークエンサを用いて皮膚から抽出したmRNAの塩基配列を決定し、得られた配列群を利用して皮膚の遺伝子発現プロファイルを構築するとともに、それぞれの遺伝子発現量の比較を行った。実験には野生型、黒色眼、灰色眼および透明ガエルを用いた。これらの皮膚RNAを抽出し、cDNAライブラリ作成、シークエンスを行った。その結果、合計約30Gbpの塩基配列を得た。これらについてアセンブラを用いてコンティグ配列を構築したところ、約23万の遺伝子配列が出力された。このコンティグ配列に各サンプルのリードをマッピングし、各遺伝子にマップされたリード数を統計的手法により群間比較したところ、黒色眼と透明ガエルでは1238、灰色眼と透明ガエルでは387の発現変動遺伝子が検出された。遺伝子ネットワーク解析の結果、前者ではアミノ酸生合成経路、後者ではホルモン刺激などに関わる遺伝子群との関連性が示唆された。
1 0 0 0 OA SINE法を用いたアカガエル類の系統関係の解明と大陸移動に関わる分岐年代の再推定
アカガエル類(上科)は、大陸移動に伴い分布拡大と系統分岐を生じた分類群とされるが、従来の分子系統解析では解決できない系統額上の問題が数多く残っている。そこで従来法にはない利点を持つ、転移因子SINEの挿入に基づく系統解析によって、これらの問題を解決することを最終目的として研究を行った。これまでにアカガエル類が属するカエル亜目からはSINE配列が発見されていなかったが、本研究により、ツメガエル類で発見されていたSINE2-1XTホモログが、現生両生類の共通祖先で獲得され、多くの両生類ゲノムに現存していることが明らかとなり、アカガエル類において本SINEを用いた系統解析が初めて可能となった。