本仮説のProof of conceptが達成、実現されれば、得られうる成果の中で最大のアウトプットは「細胞外ATP代謝の破綻が引き起こす様々な炎症性疾患の根本原因が、亜鉛欠乏症に依る亜鉛要求性酵素の活性低下に基づくものである」と言う炎症性疾患の新しい治療概念や治療分子標的を生み出すものである。3年間で申請した本研究の最終目標は、研究代表者がこれまで探索してきた高活性の亜鉛錯体を用いることで、上記のターゲットバリデーションが正しいかどうかを研究協力者(同研究室の准教授、助教、博士研究員、学生)の協力を得て多方面から詳細に検討し、亜鉛錯体によるIBDの治療戦略が可能かどうかを提案することにある。
本年度も引き続き、初代培養アストロサイトを用いてのin vitro実験、並びにうつ病モデルマウスの作製プロトコール及び評価系を確立するためのin vivo実験を行った。In vitro実験では、アストロサイトの異物貪食活性が酸化ストレス負荷により低下するが、これは(1)酸化ストレス負荷による細胞内遊離型亜鉛レベルの増大、(2)P2X7受容体のスプライスバリアント群の発現割合の変動、そして(3)P2X7受容体の細胞膜からサイトゾルへの局在変化に伴ったチャネル/ポア活性の低下に起因するものであることを明らかにした。これらの成績は、うつ病におけるアストロサイトの機能変動が、少なくとも一部、酸化ストレス負荷によってアストロサイトにおけるP2X7受容体‐亜鉛シグナリングの変動に起因することを示すものである。うつ病モデルマウスは、chronic mild stress及びsocial defeat stressをマウスに負荷することにより作製し、social interaction試験、強制水泳試験、尾懸垂試験、スクロース嗜好性試験、脳海馬領域での炎症性サイトカインの発現などにより、ストレス感受性及びうつ様行動を評価する実験系をほぼ確立できた。さらにこれまでの検討により、うつ様行動を誘発するためのモデル間、並びに使用するマウス系統間で、ストレス感受性やうつ様行動誘発に差異のある傾向を見出しており、今後、その再現性を含め引き続き実験を行う予定である。
2 0 0 0 OA 多能性幹細胞の運命決定における薬学的制御と再生医療への発展
- 著者
- 西村 周泰 高田 和幸
- 出版者
- 京都薬科大学
- 雑誌
- 京都薬科大学紀要 = Bulletin of Kyoto Pharmaceutical University (ISSN:24354112)
- 巻号頁・発行日
- vol.3, no.1, pp.37-55, 2022-07-13
2 0 0 0 OA 薬学教育においてどのような哲学・倫理教育が必要か?
- 著者
- 坂本 尚志
- 出版者
- 京都薬科大学
- 雑誌
- 京都薬科大学紀要 = Bulletin of Kyoto Pharmaceutical University (ISSN:24354112)
- 巻号頁・発行日
- vol.1, no.2, pp.119-125, 2020-10-20
2 0 0 0 OA Gタンパク共役型脂質受容体の消化管炎症の調節における役割の解明
- 著者
- 塚原 卓矢
- 出版者
- 京都薬科大学
- 雑誌
- 研究活動スタート支援
- 巻号頁・発行日
- 2015-08-28
GPR35の活性化は大腸上皮細胞の修復を促進し、さらに大腸炎を抑制することが判明した。その作用機序として、GiタンパクカップリングによるcAMP低下、フィブロネクチンおよびインテグリンα5発現亢進およびERK活性化作用を介すると推察された。一方、GPR40活性化はDSS誘起大腸炎の発生および治癒に対して保護作用を発揮することが判明した。この作用は、GLP-2産生の増大を介するものと推察される。これらの結果より、GPR35およびGPR40を代表とするGタンパク共役型脂質受容体は炎症性腸疾患の新規治療標的として有用であると考えられる。
1 0 0 0 OA ロスバスタチンと酸化マグネシウムの相互作用を疑った症例
- 著者
- 平野 徹 豕瀬 諒 村木 優一
- 出版者
- 京都薬科大学
- 雑誌
- 京都薬科大学紀要 = Bulletin of Kyoto Pharmaceutical University (ISSN:24354112)
- 巻号頁・発行日
- vol.3, no.1, pp.151-154, 2022-07-13
1 0 0 0 OA アルツハイマー型認知症治療を目指したインスリン経鼻投与後の新規脳内送達法の開発
本研究では、インスリンに各種吸収促進剤を併用した際のインスリンの脳移行性について検討した。その結果、 N-アシルタウリンの一種である sodium methyl lauroyl taurate (LMT) や sodium methyl cocoyl taurate (CMT) の併用により、血漿中インスリン濃度は上昇したものの、インスリンの脳移行性は逆に低下することが認められた。また、他の吸収促進剤をインスリンと併用した際も同様の結果が得られた。以上のことから、これら吸収促進剤は、インスリンの脳移行性には効果が見られないものの、経鼻投与後の全身循環系への移行性を改善できることが認められた。
1 0 0 0 染色体分配における新規核蛋白質p35の機能解析
(1)p35誘導高発現系の確立:HA-tag付加p35をドキシサイクリン(Dox)で誘導過剰発現できるHeLaの安定なクローン細胞、2株を分離した。これらの細胞でHA-tag-p35の細胞内局在は内在性p35と同一だった。今後この系で、p35の細胞周期における役割を詳細に解析できることが期待される。(2)p35の細胞内局在:p35特異抗体(#23)を93-112番目のアミノ酸配列に対するペプチド抗体として作成した。正常ラット細胞とヒHeLaを#23、中心体特異蛋白質γ-tubulinに対する抗体、Hoechst33342(染色体を染色)で三重蛍光染色を行なった。p35は間期細胞では中心体と核に局在した。M期の前中期から後期ではp35は細胞質と中心体に局在したが、終期では中央体にも存在した。(3)p35はM期特異的にリン酸化され異常な分子量シフトを示すリン酸化蛋白質である:1)ノコタゾール(Noc)処理によりM期前期に停止した3Y1細胞抽出液を#23でWestern blotをおこなった。間期細胞での35Kのかわりに44Kと46K(44/46K)の新たなバンドが検出された。44/46Kバンドは中期の細胞まで検出されるが後期、終期の細胞では消失し、代わりに35Kが検出された。2)M期前期の3Y1細胞抽出液をphosphatase処理すると、44/46Kバンドは消失し約36Kバンドが出現した。Noc処理3Y1細胞を^<32>Piで標識し#23抗体で免疫沈降するとリン酸化44/46Kのみが検出された。リン酸化アミノ酸分析の結果、44/46Kはセリンとスレオニンがリン酸化されていた。GFP-tag-p35(65K)を高発現する細胞をもちい同様の実験を行った。但し免疫沈降は#23と抗GFP抗体を用いておこなった。M期でのみリン酸化75Kが両抗体で検出され、セリンとスレオニンとがリン酸化されていた。尚、#23で内在性リン酸化44/46K(リン酸化75Kの20%弱)も免疫沈降した。さらにリン酸化部位もリン酸化75Kと同一だった。間期では弱いながら65Kのリン酸化が認められ、その部位はセリンのみであった。以上から、M期でのp35はリン酸化され、高次構造が変化し、SDS-PAGEでの10Kに及ぶ分子量シフトをしめす。リン酸化による高次構造の変化にはスレオニンのリン酸化が重要であることが強く示唆された。 (投稿準備中)
- 著者
- 児島 悠史 辻本 雅之
- 出版者
- 京都薬科大学
- 雑誌
- 京都薬科大学紀要 = Bulletin of Kyoto Pharmaceutical University (ISSN:24354112)
- 巻号頁・発行日
- vol.2, no.1, pp.74-77, 2021-05-14
1 0 0 0 OA 脳ニューロステロイドをターゲットとした新規アトピー性掻痒治療薬の創出
本研究の目的は,脳ニューロステロイドであるアロプレグナノロン(ALLO)とアトピー性皮膚炎における痒みとの関係を明らかにし,新規掻痒治療薬ターゲットを創出することである。特殊飼料給餌によりアトピー性皮膚炎様症状を発症したマウスにALLOを全身投与すると掻痒様行動が顕著に増加した。このALLO誘発掻痒には,脳内GABAA受容体機能亢進作用が関与することを明らかにした。また,ALLO合成酵素阻害薬finarsterideの投与によりエタノール誘発性掻痒が抑制されたことから,内因性に産生されたALLOが痒みを誘発する可能性が示された。
1 0 0 0 ポリフェノールの大腸デリバリー化による大腸潰瘍発症予防の研究
ポリフェノールの一つとして、ウイスキー中に多量に含有されているエラグ酸(EA)が前年度までの検討により胃粘膜保護作用および抗酸化作用を有することが示してきたが、さらに今年度は、新たに開発された大腸デリバリー化のための圧感応性カプセルに封入したEAを用い、デキストラン硫酸(DSS)によって誘発される潰瘍性大腸炎の発症に対するEAの効果を検討した。1.圧感応性大腸デリバリーカプセルPressure-controlled colon delivery capsule(PCDC)の使用により、投与されたEAは盲腸部に到達した後に徐々にカプセルから遊離溶出することが判明した。2.ラットにDSSを7日間連続投与することにより、体重減少、大腸の短縮化ならびに下血および下痢を伴う重篤な大腸炎が発生した。DSSによる大腸炎の発生は、PCDCに封入したEA(mcEA : 1-10mg/kg)を1日2回、7日間連続経口投与することによって、用量依存的かつ有意に(>3mg/kg)抑制された。また、mcEAの投与はDSS処置下に認められる大腸の短縮化、脂質過酸化を正常レベルにまで低下させると共に、好中球の浸潤に対しても抑制傾向を示した。なお、DSS誘起大腸炎に対するmcEA(3mg/kg)の保護作用はスーパーオキサイドジスムターゼ(SOD : 30000units/kg×2)の直腸内投与で得られた効果と同程度であり、また同用量のEA原末と比べて有意に強いものであった。3.これらの結果は、EAがポリフェノールとして抗酸化作用により、臨床における潰瘍性大腸炎の治療に有効性を発揮する可能性が示唆された。
1 0 0 0 チアゼトキノロン系抗菌剤の合成に関する研究
1 0 0 0 新規三環性チアゼトキノロン系抗菌薬の生物活性
1 0 0 0 金属-ポドフイロトキシン関連錯体による塩基特異的DNA切断反応
前年の成果を踏まえて、本年度は、ポドフィロトキシン関連化合物として、シリンガ酸(SA)およびデメチルエピポドフィロトキシン(DEPD)の選び、これらの銅(II)錯体によるDNA切断反応を検討した。まず、アガロースゲル電気泳動法によりM13mp18ssDNAを用いて、銅錯体によるDNA切断反応が生ずること、及び銅(II)単独又は薬物単独ではDNA切断は生じないことを確認した。次に、同じ系によりポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてシークエンス反応をおこなった。その結果、SAーおよびDEPDー銅錯体によりDNA切断反応は塩基特異的に生じていること見い出した。すなわち、同系によるDNA切断反応は、シトシン(C)部位で切断が優先的に生じていることが明かとなった。また、チミン(T)やグアニン(G)部位においても切断が見られたが、C部位と比較するとその程度は低かった。アデニン(A)部位ではDNA切断はほとんど生じていないことが判った。次に、ポドフィロトキシンに鉄(III)を共存させ、紫外線照射を行うとDNA切断反応が増大し、かつ反応中に・OHの生成が認められるため、本反応における酸化生成物の同定を試みた。反応を行った後、薄層クロマトグラフィー及び液体クロマトグラフィーにより化合物を分離精製し、NMRを用いて構造解析を試みたところ、現在、4種の化合物を同定することができた。しかし、まだ十分量を得ることが困難であるため、詳細な物性やDNA切断反応を行っていない。この検討を続け、十分量得ること、さらに未同定の化合物の構造決定を行いたいと考えている。これらの知見により、詳細な紫外線照射下における活性酸素生成に関する考察を行うことを計画している。
1 0 0 0 OA 生体分解性マイクロニードルを用いたテリパラチドの次世代型経皮吸収製剤の開発
本研究では、新規骨粗鬆症治療薬であるテリパラチド(hPTH) をマイクロニードル (MN)に封入した hPTH 封入 MN (hPTH-MN) を作製し、その皮膚透過性の改善を試みた。放出試験において、MN に含有された hPTH は、試験開始後5分までにほぼ全量が速やかに放出された。また、hPTH-MN 皮膚適用後の血清中 hPTH 濃度は速やかに上昇し、高い吸収性を示した。さらに、骨粗鬆症モデルに hPTH-MN を適用後、薬理効果を示すことが明らかとなった。最後に、hPTH-MN 適用後、水分蒸散量の上昇が一時的であったことから、皮膚への障害性はほとんどみられないことが認められた。
セパシア菌(Pseudomonas cepacia)の外膜に存在する透過孔は,2つの異なるサブユニット(OpcP1およびOpcP2)により形成されているヘテロオリゴマー(OpcP0)であることを既に明らかにした。本年度の研究として,【.encircled1.】このサブユニットをコードする遺伝子のDNA塩基配列を明らかにすること,【.encircled2.】2つのサブユニットを精製し,それから元のオリゴマーを再構成すること,さらに【.encircled3.】それらを透過孔形成能を調べることを計画した。その結果,【.encircled1.】精製したOpcP1の部分アミノ酸配列から作成したDNAプローブを用いて,セパシア菌の染色体クローンバンクから,PCR法によりOpcP1断片を得た。このDNA配列は,数種のポーリンとの類似性を示した。また,OpcP2遺伝子についも同じ方法で研究を進めている。【.encircled2.】精製したサブユニットから,もとのオリゴマーを再構成することが出来た。また,精製したサブユニットの透過孔形成能を測定したところ,【.encircled3.】OpcP2では活性は観察されなかった。一方,OpcP1の活性は,もとのオリゴマーであるOpcP0の活性よりも高いことが分かった。これらの結果は,OpcP1によって形成された透過孔が,OprD2の結合により阻害されていること,さらに,緑脳菌(P.aeruginosa)のOprD2のゲート領域(孔の開閉を司る領域)とOpcP2の機能が類似していることを示している。遺伝子レベルでの研究は,その遂行のために克服すべき問題が幾つかあったために,本研究ではその解決に終始した。しかし,これは,今後の研究に大いに役立つものである。蛋白質レベルでの研究過程で明らかにしたOpcP0とOpcP2との類似性は,今後得られるであろう遺伝子レベルでの研究成果と相俟って,ポーリン研究に大きな情報を提供するものと期待される。