著者

井部 明広

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

no.21, pp.91-92, 2011-03-31

著者

松田 美和子

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

vol.25, pp.80, 2014-03-31

著者

村田 倫子

出版者

麻布大学

巻号頁・発行日

2014

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The African penguin (Spheniscus demersus), which is endemic to southern Africa, is one of the world's most endangered seabirds. While wild African penguin populations continue to decrease, properly maintained captive populations are steadily increasing each year. To avoid close inbreeding and to maintain genetic diversity, the Japanese Association of Zoos and Aquariums keeps studbooks, which it uses to promote long-term breeding plans. However, genetic data have not been collected on either wild or captive African penguins in Japan to date.This study addresses the genetic characterization of captive African penguins in Japan, and is organized into four chapters. The first and second chapters describe the genetic diversity and phylogenetic relationships among African penguins based on mitochondrial and microsatellite DNA. The third chapter characterizes DNA markers isolated from African penguins. The fourth chapter includes an analysis of the karyotype and nucleolus organizer region of the African penguin. Chapter 1 Mitochondrial DNA analysis of captive African penguins in Japan According to the 2011 Japanese regional studbook for the African penguin, they were first introduced to Japan in 1935, and 156 additional founders were introduced from 1973 to 2011. The captive African penguin populations in Japan comprise 485 individuals belonging to an estimated 87 different founder lineages. In this study, 236 African penguin samples derived from 62 founder lineages were analyzed based on two mitochondrial DNA (mtDNA) regions. 1) Analysis of the control region Multiple sequence alignments of the 433-bp partial control region showed 39 polymorphic sites and a total of 30 distinct haplotypes. Neighbor-joining (NJ) phylogenetic analysis using the sequences revealed that the captive African penguins clustered into two clades (A and B) supported by high bootstrap values. The divergence between African penguin clades A and B (d = 3.39%) observed in the present study may reflect geographical isolation, the existence of undefined subspecies, or both, although it must be noted that our data focused on captive-bred individuals.2) Analysis of the cytochrome b gene The complete 1140-bp sequence of the cytochrome b gene was obtained from 54 captive African penguins in Japan. We detected 8 haplotypes defined by 11 variable sites. NJ phylogenetic analysis using the cytochrome b sequences identified two clades similar to those observed using the control region. These mtDNA analyses suggest that captive African penguins in Japan are derived from two distinct maternal lines.Chapter 2 Genetic population structure of captive African penguins in Japan based on microsatellite DNA analysis Eight microsatellite loci (Sh1Ca12, Sh1Ca16, Sh2Ca21, PNN01, PNN03, PNN06, PNN09, and PNN12) were examined to estimate the genetic variability and relationships among 178 captive African penguins derived from 58 founder lineages. Deviation from Hardy–Weinberg equilibrium and linkage disequilibrium were not observed for any of the markers. Mean HE (expected heterozygosity) and HO (observed heterozygosity) values ranged from 0.45 to 0.72 and from 0.45 to 0.71, respectively. These heterozygosity values for captive African penguins were higher than those of a previously described wild population of yellow-eyed penguins (Megadyptes antipodes). A Bayesian clustering method was used to characterize genetic differentiation among populations, and three subpopulations of captive African penguins were inferred.Chapter 3 Isolation and characterization of novel DNA markers from the African penguin Four methods were used to isolate genetic markers specific to the African penguin.1) Isolation of a satellite DNA fragmentA 190-bp satellite DNA fragment (a type of repetitive DNA) was isolated by digesting African penguin genomic DNA with the resection enzyme BmeT110. PCR analysis with newly designed primers based on the sequence showed that the repetitive DNA sequence was shared among spheniscid species. Southern blot hybridization analysis was performed using the satellite DNA fragment as a probe. Hybridization with genomic DNA from the African penguin, Magellanic penguin, and Humboldt penguin, which all belong to genus Spheniscus, generated ladder signals of tandem repeats, whereas non-tandem repetitive signals were found in genera Pygoscelis and Aptenodytes.2) DNA markers obtained by randomly amplified polymorphic DNA Randomly amplified polymorphic DNA PCR techniques were used to identify a 778-bp band that differentiates the African penguin from the Humboldt penguin in addition to several common bands. Cloning and sequence analysis of the unique band and band-specific PCR analysis showed that the fragment was common to spheniscid species.3) DNA markers obtained by mini/microsatellite-associated sequence amplification analysis Mini/microsatellite-associated sequence amplification (MASA) techniques were used to generate a prominent 540-bp band that differentiates the African penguin from the Humboldt penguin. Cloning and sequence analysis of the unique band, and subsequent band-specific PCR analysis showed that this fragment distinguished genera Aptenodytes and Pygoscelis from genera Spheniscus and Eudyptes.4) Representational difference analysis Three series of representational difference analysis were performed using a combination of African penguin amplicons as testers and Gentoo penguin amplicons as drivers. One informative polymorphic marker, present exclusively in Spheniscus and Eudyptes, was obtained. No polymorphic DNA fragments were isolated when amplicons prepared from the Humboldt penguin were subtracted from those prepared from the African penguin.Chapter 4 Karyotype of the African penguin The African penguin karyotype was analyzed. To obtain metaphases, the direct culture technique was used for peripheral blood lymphocytes. The chromosome number of the diploid African penguin was, for the first time, determined to be 76 (2n = 76), where 7 pairs of autosomes and a pair of sex chromosomes were considered macrochromosomes, and the remaining 30 pairs (60 chromosomes) were microchromosomes. According to several previous studies, the diploid chromosomal numbers of the Magellanic penguin and the Humboldt penguin were 68 and 78, respectively. While the number of macrochromosomes was constant among species of genus Spheniscus, the number of microchromosomes varied. Taken together, we demonstrated the existence of two divergent clades of captive African penguins with moderate genetic distance based on mtDNA sequence analyses. Next, we showed three different subpopulations within the African penguin. The population of captive African penguins in Japan was derived from multiple genetic origins, resulting in genetic diversity. Moreover, we isolated DNA markers shared among family Spheniscidae, but did not detect genetic markers specific to the African penguins. This finding suggests that penguin species in Spheniscus, including the African penguin, have a high level of genetic homogeneity. In addition, the African penguin karyotype was determined for the first time. These molecular analyses should be useful to Japanese zoos and aquariums for future management decisions and the implementation of breeding programs.

著者

山田 澄夫

出版者

麻布大学

巻号頁・発行日

1976-11-29

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ブドウ球菌食中毒は,黄色ブドウ球菌が産生するエンテロトキシン(以下Entと略)を含んだ食品をヒトが摂取することにより生ずる典型的毒素型細菌性食中毒である。本食中毒の原因物質がEntであることは,すでに1930年代より明らかにされ,現在までに抗原特異性を異にするA,B,C,DおよびEの5型の存在が確認されている。 著者は本毒素の検査体系-特にEntの検出法の確立-と本食中毒予防の基礎を確立するための研究を行った。以下,各項芦別にその概要をのべる。1.Ent A,B,C,DおよびEの精製 本菌食中毒はわが国のみならず文明諸外国においても高い発生を示しており食中毒発生に際しての確実な診断および疫学調査は公衆衛生上極めて重要な課題となっている。本菌食中毒の最も確実な診断は,推定原因食品中に極めて微量に含まれるEntを検出することである。微量毒素の検出法としては,型特異的抗Ent血清を用いた逆受身赤血球凝集反応やradioimmunoassayなどによる抗原-抗体反応が有効であるが,これらの方法を応用するためには極めて高い特異性を持つ抗血清ないし抗体グロブリンが必要である。それにはA~Eの各Entを免疫学的に均一な標品までに精製し,それを免疫原として型特異的抗血清を作成することである。 一方,毒素分子の構造と抗原性や毒素活性との関係,毒素の作用機序の解明のためにも精製毒素を得ることが必要である。 これまでにも主として米国の一部の研究所や大学においてEntの精製が試みられてきたが,著者は以下の本毒素産生菌株と精製操作により,A~Eのすべての型のEntの簡易精製を試み,高純度な精製標品と型特異的抗Ent血清を得ることができた。 Ent A~Eの産生に用いた黄色ブドウ球菌は,A型に13N-2909,B型にC-243,C型に493,D型に1151,E型にFRI326の各菌株である。毒素産生培地としては,4%NZ-amine培地を用い,37C,24~48時間振とう培養し,その遠心上清を精製の出発材科とした。精製過程におけるEntの検出はreference抗Ent A~E血清を用いたスライドゲル内沈降反応と,サルへの経口投与または静脈内接種による嘔吐発現の有無により,精製標品の純度は後述の各EntのAmberlite CG-50画分(以下粗毒素と略)をウサギに免疫して得た抗粗毒素血清とのOuchterlonyのゲル内沈降反応により検討した。 Ent精製の第1段階では,濃縮操作と部分精製をかねてすべての型に共通にAmberlite CG-50.クロマトグラフィーのバッチ法を用いた。その結果,いずれの場合も多量の培養上清から効率よくEntを濃縮することが可能であった。 本実験に供したAおよびB産生株にα-溶血毒を産生しないため,Ent AとBの精製では,ついでCM-セルロースクロマトグラフィーとSephadex G-75またはG-100のゲルろ過を組み合わせた3段階の操作により,免疫学的に単一な精製標品を得ることができた。この方法による回収率はAでは36%,Bでは40%であった。 一方,培養上清中に多量のα-溶血毒を含むEnt C_2,DおよびEの精製では,上記3段階の操作に,Entとα-溶血毒の分別方法としてDEAE-セルロースクロマトグラフィーを導入した。Ent Eの精製では,さらに他のタンパク夾雑物を除去するためにDEAE-セルロース再クロマトグラフィーを用いた。その結果,Ent C_2は4段階,Eは5段階で精製標品を得ることができ,その回収率は10%および5%であった。しかしながら,Ent DはDEAE-セルロース再クロマトグラフィー,6M尿素を用いたSephadex G-75ゲルろ過,等電点分画の7段階の操作によってもなお,最終標品からEnt以外のトリプシン抵抗性のタンパク夾雑物を分別することはできなかった。 各最終標品で免疫して得た抗血清はOuchterlonyのゲル内沈降反応において,抗Ent A~C_2およびE血清は対応する精製毒素と粗毒素に対して1本の沈降線を形成し,それらはreference Entとその抗血清が形成する沈降線と完全に融合した。抗Ent D血清は粗毒素に対して2本の沈降線を形成したが,非Ent画分をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーにより, 特異性の高い抗血清を作成することができた。 各標品の免疫学的特異性をゲル内沈降反応と催吐活性中和試験で検討した結果,各標品は対応する抗血清とのみ沈降線を形成し,その催吐活性は特異的に中和された。逆に,他の型の抗血清とは沈降線を形成せず,その活性も中和されなかった。 以上の結果から,既知あるいは未知のEntは簡易化した同一精製法-α-溶血毒非産生株は1),Amberlite CG-50を用いたバッチ法による培養上清中のEntの濃縮,2),CM-セルロースクロマトグラフィー,3),Sephadex G-75ゲルろ過の3段階,α-溶血毒産生株はこの過程にDEAE-セルロースクロマトグラフィーを導入した4段階-で高純度な精製標品を得ることが可能であると推定された。2.精製毒素の物理化学的性状 精製毒素の物理化学的性状,酸・アルカリおよびタンパク分解酵素などに対する安定性,生物活性基と抗原決定場の決定および毒素と生体内レセプターとの相互作用などの毒素学的追求は,タンパク化学的見地から極めて興味ある問題であり,しかも毒素の作用機序を明らかにする重要な手がかりを与えるであろう。現在までに,これら研究の大部分は産生量が多く,精製の容易なEnt Bについてなされているに過ぎず,他の型の毒素についての研究は極めて少ない。本菌食中毒事例で最も高頻度に検出されるEnt型がAであるという事実を考慮に入れるならば,Ent Aの性状の検討は極めて重要な意味を持っているといえる。 著者は前項でのべたEnt精製法により得た精製標品,特に本菌食中毒で主役を演じているEnt Aの物理化学的性状を明らかにするとともに,他の型の毒素についても検討を加えた。 精製Ent Aは250nmに極小吸収,277nmに極大吸収を持ち,核酸,脂質および炭水化物を含まないトリプシン抵抗性の単純タンパクであった。精製毒素のシュリーレンパターンは3時間,経時的に測定しても左右対称で毒素分子の均一性が示され,そのS_20wは2.71S,分子量はSephadex G-75ゲルろ過法で26,000,SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で27,000,沈降平衡法で30,000と推定された。精製毒素はisoelectrofocusingにより血清学的に同一なpH7.0とpH6.5の2つの大きな画分とpH8.0の小さな画分に分画された。最大のEnt画分を示したpH7.0を本毒素の等電点(Ip)とした。アミノ酸分析の結果,精製毒素は214個のアミノ酸残基から成り立っていると推定された。各アミノ酸残基数は,アスパラギン酸34,グルタミン酸25,ロイシン22,リジン21,スレオニン,グリシン,チロシン各15,バリン13,セリン,イソロイシン各10,フェニールアラニン8,アラニン7,アルギニン6,ヒスチジン5,トリプトファン4,プロリン3,メチオニン1であった。 精製Ent Bは250nmに極小吸収, 277nmに極大吸収を持ち,核酸,脂質および炭水化物を含まないトリプシン抵抗性の単純タンパクであった。精製毒素のシュリーレンパターンは各時間において左右対称を呈し,そのS_20wは2.68S,分子量はSephadex G-50ゲルろ過法で29,000と推定された。精製毒素はisoelectrofocusingにおいて,血清学的に同一なpH7.62,pH8.35,pH8.70の3画分に分画され,pH8.35を本毒素の等電点とした。 精製Ent C_2とEも250nmに極小吸収,227nmに極大吸収を持ち,核酸,脂質および炭水化物を含まない単純タンパクであった。両毒素ともその分子量はSephadex G-50ゲルろ過法で29,000と推定された。精製Ent C_2もisoelectrofocusingにおいて,pH6.55とpH6.70の2つの大きな画分およびpH6.0とpH8.0の2つの小さな画分に分画され,pH6.70を本毒素の等電点とした。 精製Ent A~C_2およびEはpH4.3でのディスク電気泳動において単一なバンドを形成したが,pH9.4での泳動では2~4本のバンドを形成することを認めた。pH9.4での泳動で分画される複数のバンドは血清学的には同一で,しかもisoelectrofocusingで得られた画分に相当することをEnt Aで実証した。この複数のバンドは,超遠心分析およびHedrick-Smith法による分析結果から,毒素分子の分子サイズの違いによって生じるものでなく,Chargeの差を異にするcharge isomerに起因するものであると推定された。 以上の結果から,Entは分子量26,000~30,000,沈降定数(S_20w)2.7S前後のいくつかの異なった等電点を有するトリプシン抵抗性のcharge isomerタンパクであろうと結論された。Ent Dは完全には精製されなかったが,本毒素も他の型の毒素と同様の物理化学的性状を有する分子量約29,000,等電点7.70前後のトリプシン抵抗性の単純タンパクであろうことが初めて推察された。3.Entの加熱に対する安定性 Entは耐熱性毒素であるため,本毒素を含んだ食品は加熱調理後も,本菌食中毒の原因食品となり得ると考えられている。したがって,本毒素の耐熱性に関する問題は,食品衛生上極めて重要である。しかしながら,Ent A~Eの加熱処理による毒素活性の変化の差を比較検討した成績はほとんど得られていないのが現状である。 本菌食中毒の予防の立場から極めて重要な問題である毒素活性と熱処理の関係を,得られた精製Ent A~C_2および粗毒素A~Eを用いて検討した。加熱温度は60C,80Cおよび100Cとし,各5時間加熱処理による毒素の抗原性の経時的変化を特異抗血清を用いたOudin法により推定した。各毒素は50μgを0.05Mリン酸緩衝食塩水,pH7.2に溶解し,所定の温度で加熱した。 精製Ent Aは60C,3時間,80C,5時間,100C,1.25時間で50%失活し,100,2時間で完全に失活した。粗毒素Aは60Cおよび100C,1時間,80C,5時間で50%失活し,100C,2時間で完全に失活した。 精製Ent Bは60C,5時間で20%,80C,3時間および100C,20分で50%失活し,80C,4時間および100C,1時間で完全に失活した。粗毒素Bは60C,5時間,80Cおよび100C,10分で50%失活し,80C,4時間および100C,1時間で完全に失活した。 精製Ent C_2は60Cおよび80C,5時間で25~30%,100C,2時間で50%失活し,100C,3時間で完全に失活した。粗毒素C2は60Cおよび80C,4時間,100C,50分で50%失活し,100C,3時間で完全に失活した。 粗毒素Dは60C,2時間,80C,4時間,100C,20分で50%失活し,100C,1時間で完全に失活した。 粗毒素Eは60C,5時間で30%,80C,1.5時間,100C,30分で50%失活し,100C,1時間で完全に失活した。 以上の結果から,精製毒素は粗毒素よりも耐熱性であり,各毒素の加熱に対する安定性は毒素型によって異なると考えられた。Ent A,C_2,Dが高温度で比較的安定であることは,後述のごとく本菌食中毒原因食品から検出される黄色ブドウ球菌はこれらの型の毒素を産生するものが多い成績から,食中毒発生との関係上特に注目された。 Ent A,C_2およびDは80Cより60Cで早く不活化され,AおよびC_2では粗毒素のみならず精製毒素においてもこの現象が観察された。この現象が一部の細菌タンパク毒素で認められている加熱温度差によるタンパク分子の立体構造の変化によるものか否かを,精製Ent Aを用い,加熱-再加熱の実験系で検討した。その結果,60C,1,2,3,4および5時間加熱した各試料は80C,40分の再加熱により20~45%の活性の復元が認められた。60Cで加熱された試料は微細絮状物を形成して混濁したが,再加熱により絮状物は消失して透明となった。Ent A,C_2およびDで認められるこの特異的な熱安定性は,低温度(60C)でのタンパク分子の集合(aggregation)と高温度(80C)での再加熱による分子の解離(dissociation)によるものであることが推察され,この特性は本毒素の活性と構造との関係を解析するうえで重要な手がかりを与えるものであることが強く示唆された。4.毒素産生性黄色ブドウ球菌の分布と本菌食中毒発生との関連について 本菌食中毒は,他の細菌性食中毒が食品衛生意識の向上にともない減少しているのに対し,漸次増加の傾向すら認められている。このことは食品が高頻度に黄色ブドウ球菌に汚染されていることを意味するものである。ヒト,動物その他これらを取り巻く環境に広く分布するすべての黄色ブドウ球菌がEnt産生能を有し,食中毒の原因となりうるならば,生態系と食中毒で検出される本菌のEnt産生能とその型別には密接な関係があるはずであり,その検討は本菌食中毒の予防対策に重要な手がかりを与えるであろう。 以上の理由から,食中毒由来黄色ブドウ球菌と自然界由来黄色ブドウ球菌のEnt産生能とその型別を行った。 供試菌株として,1969~74年にかけて東京都内で発生した103事例の本菌食中毒の原因食品から検出した食中毒由来103株,自然界由来株は各種材料より本菌が検出されたもののうち1検体より各1株を任意に選んだもので健康人の糞便由来98株,鼻前庭由来99株,食品調理人の手指由来96株および市販食品由来99株,計392株である。Entの検出は,上記菌株の4%NZ-amine培養上清を1/50に濃縮したものを抗原液とし,本研究で作成した特異抗Ent A~E血清を用いて5μg/mlの本毒素を検出できるスライドゲル内沈降反応により行った。 食中毒由来103株中97株がA~Eのいずれか,もしくは数種のEntを産生した。そのEnt型はA型39株,C型16株,A・CおよびA・D型各11株,D型9株,B型6株,A・C・D型2株,A・C・E型1株であった。 自然界由来株は392株中272株(69.4%)がEnt産生株であった。各種材料由来株の産生Ent型は,健康人糞便由来株ではC型35株,A・C型9株,AおよびD型各6株,A・D型5株,B型4株,C・E,A・C・DおよびA・C・E型各1株,鼻前庭由来株ではC型19株,A・C型13株,A型9株,B,DおよびC・D型各5株,A・C・D型3株,B・DおよびA・B・D型各2株,A・B,A・DおよびA・B・C型各1株,調理人手指由来株ではC型29株,A型11株,B型7株,A・C型6株,A・D,C・DおよびA・C・D型各3株,DおよびB・C型各2株,A・BおよびB・C・D型各1株,食品由来株ではC型26株,A型18株,A・D型7株,DおよびA・C型各6株,A・C・D型4株,B型2株,C・D型1株であった。 食中毒由来株はEnt A産生株が多いのに対して,自然界由来株は各種材料ともEnt C産生株が多く認められ,食中毒と生態系の黄色ブドウ球菌のEnt型別分布は必ずしも同一でないことが示された。この違いが本菌食中毒発生にいかなる意味を持つのか,この点に関する今後の検討が本菌食中毒の予防の立場から極めて重要であると考えられた。

著者

加藤 基惠

出版者

麻布大学

巻号頁・発行日

1986-06-04

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生物の生活環境中には遺伝子レベルでの障害あるいは染色体異常を誘発させる化学物質が多数存在している。 それらの中,特に遺伝的障害を発現する化学変異原物質を検出するために数多くの検出系が考案されている。マウスを用いての実験においては生殖細胞の染色体異常の検出系として優性致死試験や遺伝性転座試験が多く用いられている。しかし,これらの検出系は実験の規模が大きく簡便とはいえない。一般に個体の発生は生殖細胞が合体した1細胞期胚から始まると言える。従って,両親のうちのいずれかの生殖細胞において誘発された障害,あるいはこの障害をもつものを親とする次世代における染色体レベルの遺伝的障害は,さかのぼって1細胞期胚における染色体異常の有無を検索することにより,事前に発見できる可能性があると考えられる。さいわいマウスの1細胞期胚の染色体は特異的で,精子由来と卵子由来の染色体が識別できるので雌雄いずれからの異常かが判別可能である。しかし,1細胞期胚の染色体異常に関する報告は少なくさらに1細胞期胚の染色体異常と他の遺伝的障害との関連性についても明らかにされていない。このことは1細胞期胚の染色体標本作製技術にも問題があると考えられる。 今回の研究は,まず第1にマウス1細胞期胚の染色体標本作製法の改良・開発,第2に,この改良・開発した方法を利用することによって,1細胞期胚の染色体分析結果が環境変異原により発現される優性致死作用や次世代の転座ヘテロ個体の誘発頻度を事前評価できる簡便な検出系になりうるかどうかを検討することを目的とした。そのため既知の化学変異原物質を雄マウスに投与することにより,受精前の配偶子あるいは 受精後の1細胞期胚及び障害を持つ雄による次世代のF_1個体に亘っての障害を明らかにするため種々の実験を実施した。 実験材料と方法 9週齢の雄マウス(Slc-BDF_1)を用い,体重1kgあたり,以下の各変異原物質のそれぞれの量を単独で1回,腹腔内に投与した。 Methyl methanesulfonate (MMS, 100mg) Cyclophosphamide (CPA, 240mg) Trimethylphosphate (TMP, 300mg) Nitrogen mustard-N-oxide hydrochloride (HN_2-O, 100mg) iso-propyl methanesulfonate (i-PMS, 200mg) Procarbazine hydrochroride (PC, 800mg) Mitomycin C (MC, 5mg) Fosfestrol (DSDP, 300mg) なお,X線照射(500 rad)雄マウスについても比較のための実験を行った。 これらの処置をされた雄マウスを経時的に成熟正常雌マウスと交配させ,著者の考案した一連の術式を用いて雌マウスより1細胞期胚を採取し,精子由来の染色体を検査した。 他方,交配後1細胞期胚を採取せず,妊娠を持続せしめた雌マウスについても経時的に着床や胚死の状況を追求すると共に分娩にまで至ったものについては新生仔中のF_1雄個体について遺伝的障害因子保有の有無を知るため,性成熟後に正常成熟雌マウスと交配させ,着床や胚死等の有無を含め,受胎状況を観察し,変異原物質を処置された初代雄の精子による次世代雄への遺伝的障害の有無についても追求した。 また,同様処置した雄マウスの精巣の組織学的所見および精子の形態異常についても検討した。 この他,雄生殖細胞のDNAレベルの障害とその修復機能を観察するため,アイソトープ(thymidine-methyl-^3H)を精巣に投与後,経時的に精子を回収し,オートラジオグラフを作製して不定期DNA合成の発現の有無についても適宜検査した。 また,精子による遺伝的障害以外に精液を介して薬物の雌体内への機械的な搬入による障害等も考慮し,精液中の薬物検出も一部実施した。 実験結果 本研究で改良・開発したマウス1細胞期胚の染色体標本作製法は従来の方法と異なり,標本作製が簡便で,しかも低数性の染色体の発現頻度が低く染色体分析の可能な標本作製についての成功率が高かった。この方法を用いて,精子細胞および精子をMMS,CPA,TMP,HN_2-O,i-PMSおよびX線で処置し,その精子による1細胞期胚の染色体分析を行った。その結果,精子由来の染色体において主に染色体型の異常が観察された。しかし,PCおよびMCで精子細胞および精子を処置した場合は,主に染色分体型の異常であった。一方,精原細胞および精母細胞をPC,MC,i-PMSおよびX線で処置した場合は不受精卵が高頻度に観察された。 変異原物質を雄生殖細胞に処置した場合の各雄生殖細胞に対する優性致死誘発率は,化学変異原物質の種類により異なり,精原細胞では高いが,精母細胞,精子細胞および精子の順に優性致死率が減少するタイプ(PC,MCおよびX線),精子細胞ないし精子に対しては優性致死誘発作用が高いタイプ(MMS,CPA,TMPおよびHN_2-O),全ての生殖細胞に対して優性致死誘発作用が高いタイプ(i-PMS)に分類された。また精原細胞および精母細胞の障害に起因する優性致死現象は着床前の胚の損失によるものであったが,精子細胞および精子に対する化学物質の影響による優性致死現象は主に着床前の胚の損失と着床後の胚死によるものであった。これらの実験結果はこれまでの報告とほぼ一致した。 精子細胞や精子に対してMMS, i-PMSおよびX線を処置した雄を用いて交配させ,排卵後72時間目の胚を回収して分析した結果,卵割遅延および卵割停止が観察され,それらの障害の程度は変異原物質の種類により異なった。 精子をHN_2-Oで処置した後に交配受精させ,出産させた次世代F_1雄の妊孕性試験の結果においては,着床後の胚の死亡を主に引き起こす半不妊および着床胚が全く観察されない不妊のF_1雄個体が高頻度に発現した。これらのF_1雄の半不妊および不妊個体の精巣組織学的検索では,不妊個体において精母細胞での精子形成阻害が観察され,一方,半不妊個体では正常な精子形成が認められた。また,これらの半不妊個体の精母細胞の染色体分析では,非相同染色体間の相互転座を示す鎖状および環状の4価染色体が観察され,相互転座ヘテロ個体であることが確認された。 他方,MMS,MCおよびi-PMSを投与された処置当代における雄について精巣の精子形成および精子の形態に対する影響について組織学的に検索した結果,精母細胞,精子細胞および精子の顕著な細胞死および精子形成阻害は観察されなかった。しかし,MCおよびi-PMSを投与した場合は,精原細胞のDNA合成阻害による一時的あるいは永久的な分裂阻害が観察され,これらの精巣は萎縮が観察された。MCを投与した場合の精子の形態異常は主に精母細胞および精原細胞処置のものに観察された。一方,精子変態を過ぎた段階での精子をMC,MMS,i-PMSおよびX線で処置した場合,精子の形態異常は観察されなかった。 生殖細胞のDNA傷害の修復を示唆する不定期DNA合成はMMS,TMPおよびPCを精母細胞および精子細胞に対して処置した場合誘発されたが,MC処置の場合は誘発されなかった。一方,精子に対してMMSおよびMCを処置した場合は誘発されなかった。 考察 以上の実験結果から,精原細胞および精母細胞処置による優性致死試験で観察された着床前の卵の損失は精原細胞の分裂阻害あるいは障害をうけた大部分の精母細胞が発生して精子変態過程において精子形態異常を引き起こし,受精能に支障を生じ,その結果,不受精卵が生じたものと推察された。一方,精子細胞や精子処置により観察された着床前後の胚の損失は,1細胞期胚の精子由来の染色体異常に起因し,染色体異常を有した1細胞期胚が発生し卵割遅延あるいは卵割停止を生じた結果胚死亡を引き起こしたものと推察された。 不定期DNA合成がDNA障害の結果発現したDNAの修復現象と仮に考えると,精子では不定期DNA合成が発現されず,修復能が欠損しているものと推察された。また,精子形成過程に対する優性致死の発現時期と不定期DNA合成の発現時期との相関性が認められないことより,この2つの現象は発現機構を異にするものと思考された。 化学変異原物質を精子細胞および精子に処置し,それを用いて受精した1細胞期胚の染色体分析で主に染色体型の異常を誘発する化学変異原物質は次代のF_1雄に高頻度に半不妊および不任を示す転座ヘテロ個体を誘発し,一方,染色分体型の異常を発現する化学変異原物質の処置では転座ヘテロ個体の誘発頻度が低い。このように,1細胞期胚で観察された染色体異常の種類および発現頻度とF_1を対象とした場合の転座ヘテロ個体の発現頻度とは相関関係が認められた。 体細胞の染色体に対する放射線と化学物質の作用の違いは,放射線は細胞周期と無関係に染色体異常を発現するものに対し,化学変異原物質はどの細胞周期に処置しても染色体異常を発現するには処置した細胞がDNA合成期を経過する必要があり,そこに発現される染色体異常は主に染色分体型であると言われてきた。しかし,本研究においては化学変異原物質を細胞周期のG_1期にあたる精子細胞および精子に処置し,受精後1回目のDNA合成期を経過した1細胞期胚の染色体分析を行った結果,体細胞の場合とはかなり異なり,主に染色体型の異常が発現された。従って,変異原物質による次世代への遺伝的障害の事前評価には生殖細胞を用いた検出系の必要性を指摘したい。 なお,化学物質を雄個体に処置した場合,その化学物質が射出精液を介して雌個体に持ち込まれ,母体に作用し,二次的に卵の発生あるいは着床に影響を及ぼす場合がありうる結果がえられた。そのため化学物質による優性致死試験の結果の評価においては,遺伝的影響以外に化学物質の射出精液を介した雌マウスへの持ち込みによる影響をも併せて考慮する必要性が指摘される。 以上の実験結果より以下の結論が得られた。 1) 本研究において改良・開発されたマウス1細胞期胚の染色体標本作製法は,簡便であるとともに,信頼度の高い方法である。 2) 1細一期胚の染色体分析は,化学物質に暴露された配偶子の受精能に対する影響も判定できる。 3) 優性致死試験で胎仔の認められない場合の原因について,これが不受精によるのか,染色体異常によるのかの判定には,1細胞期胚の染色体の分析が有効である。 4) 顕著なDNA障害を有した精子でも受精は可能であり,この場合,1細胞期胚において染色体異常が観察される。 5) 体細胞の場合と異なり,雄生殖細胞を化学物質で処置した場合は,1細胞期胚の染色体分析で,おもに染色体型の異常が発現され異常の発見が容易である。 6) 染色体異常を有した大部分の1細胞期胚は,初期胚および胎仔において発生遅延や発生停止を引き起こし,致死経過をとる。 7) 化学変異原物質で雄生殖細胞を処置した後,1細胞期胚の染色体分析で主に染色体型の異常を発現させる化学変異原物質は,次世代のF_1において転座ヘテロ個体を高頻度に誘発する。 従って1細胞期胚の染色体分析は優性致死および次世代の転座ヘテロ個体の発現頻度を事前評価でき,環境変異原物質を対象とした簡便な遺伝毒性の検出系として充分利用できるものと考えられる。

著者

小山 奈穂

出版者

麻布大学

巻号頁・発行日

2012-03-15

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近年、飼育下におけるゾウは野生個体に比べ、寿命が短く繁殖成功率も低いことが明らかにされており、動物園では飼育環境の福祉的改善が求められている。しかし、日本ではこれまでゾウの飼育環境に関する福祉評価はほとんど行なわれてこなかったため、飼育環境における改善点の抽出や長期的な繁殖計画を立てるために必要な基本的知見が不足している。そこで本研究では、国内のゾウの飼育状況を把握し、飼育下における社会的環境、物理的環境および人的環境からどのような影響を受けているのか行動学的に明らかにすることによって、福祉に配慮したより持続可能なゾウの飼育管理法について検討した。 第1章では、国内のゾウの社会環境、飼育施設および飼育管理に関する基礎的情報の収集を目的として、全国のゾウの飼育施設を対象にアンケート調査を行なった。その結果、国内47ヵ所のうち40ヵ所の飼育施設で飼育されている87個体のデータが得られた。アジアゾウは50頭(オス10頭、メス40頭〉、アフリカゾウは37頭(オス8頭、メス29頭)であった。繁殖歴のある成熟個体は7頭で、飼育下で生まれた個体は5頭であった。各施設における飼育個体数は、単独または2頭規模が大半を占め、特にメスを単独で飼育している施設は全体の3分の1に達した。また、高齢になるほど社会的規模が小さく単純になることが明らかとなった。屋内展示室の床面積は種間で差がなく、中央値は約45m^2であった。屋外放飼場の床面積は、アフリカゾウ舎(中央値340m^2)の方が、アジアゾウ舎(中央値270m^2)に比べて有意に広く設計されていた(P<0.05)。放飼場における地面の材質には、主にコンクリートや土が採用されていた。放飼場内の複雑性は、地面の材質と有意な関連性が見られ、プールや砂浴び場、泥浴び場は、コンタリートのみの放飼場よりも人工物と自然物からなる放飼場に設置される傾向が見られた(P<0.01)。取り扱い方法に関しては、メスは直接飼育、オスは間接飼育で管理されることが多く、性別により有意な違いが見られた(P<0.05)。また、夜間の繋留や一日3回以下の給餌が行なわれている個体は、全体の4~5割を占めた。9割以上の個体に対して日常的にトレーニングが実施されており、その主な目的はゾウの健康管理およびゾウと管理者の安全管理であった。トレーニング時は声がけや接触を伴っていたが、直接飼育の個体に対してはより多様な手法が用いられていた。また一日の実施時間は、間接飼育の個体では30分未満であったのに対して、直接飼育の個体では1時間以上と、より長い時間をかけて行なわれていた(P<0.01)。以上の結果から、国内のゾウは全体的に社会的規模が小さく、多くの成獣メスにおいて社会的接触の機会の不足が懸念された。また、基本的に複数頭での利用が可能な施設面積を設定している欧米の基準に比べて、国内の施設は屋内外に関わらず面積が小さく、特に屋内展示室や寝室は単頭で収容する作りになっていた。一方、放飼場の複雑性が地面の材質に依存していたことや、ゾウの取り扱い方によってトレーニングにおける方法の選択肢や実施時間に違いが見られたことから、飼育施設や飼育管理には園間で大きく異なる部分も混在していることが明らかとなった。 第2章では、飼育環境に含まれる社会的要因、物理的要因および人的要因を明らかにし、それらの因子がゾウの行動にどのような影響を及ぼしているか検討した。7ヵ所の施設で飼育されている計12頭の成獣メスを対象に、各個体につき3日間のデータを収集するために、展示時間中に見られた11項目の行動カテゴリーについて、1分間隔の瞬間サンプリングで記録した。利用場所および管理者の関わりについても同時に記録した。環境要因については、互いに独立した因子として、社会的規模(社会的要因)、展示場の利用可能面積(物理的要因)、給餌回数およびトレーニング回数(人的要因)が抽出された。日中の休息は、社会的規模の水準が上がるに従い有意に高い割合が示された(β=0.780, P<0.01)。また展示場の面積が大きいほど、採食行動は有意に多く発現したが(β=0.687, P<0.05)、反対に移動の発現割合は少ない傾向を示した(β=-0.537, P=0.06)。一方、人的要因の一つであったトレーニングにおいても、有意ではないもののいくつかの行動と関連が見られた。しかし、複数施設の比較では、社会的要因や物理的要因が強く作用することから、人的要因による影響を明確に表せなかった。そのため、各飼育環境内において対象個体を特定し、長期的な調査を行なうことが必要と考えられた。 そこで第3章では、ゾウの社会性や精神的健康性に福祉的効果をもたらしうる、日常管理や管理者の関わりについて明らかにすることを目的とした。飼育環境の社会的要因および物理的要因による影響を排除するため、名古屋市東山動植物園において1年間の行動調査を行なった。 第1節では、アジアゾウの成獣メス(38歳)1頭を対象に、管理者がゾウに対して日常的に関わることで、個体の社会性に対する配慮となる可能性を検証した。1年のうち3ヵ月を1期とし、各期につき7日間、計28日間のデータを収集するために、前章と同様、展示時間中に見られた11項目の行動カテゴリーおよび利用場所について1分間隔の瞬間サンプリングで記録した。また、管理者の関わりは、指示を伴う「トレーニング」と指示を伴わない「ハンドリング」に分けて連続記録した。一日のトレーニングの回数や1回のトレーニング時間と、常同行動の発現頻度との間には有意な相関は見られなかった。ハンドリングと常同行動の発現頻度との関連性については、1回の接触時間との間には有意な相関がなかったが、一日の接触回数とには有意な負の相関が見られた(γ_s=-0.26, P<0.05)。よって、トレーニング時以外にも関わる時間を設け、1回の接触時間を長くすることよりも一日により多く関わることが常同行動を抑制する可能性が示された。また、ハンドリングの目的には、給餌が含まれており、常同行動の発現抑制に影響を及ぼしている可能性が考えられたが、給餌目的の接触頻度の高い日と低い日における常同行動の発現頻度に有意な差は見られなかった。以上から、管理者が給餌の有無に関わらず日常管理の中でゾウと関わる機会をより多く作ることは、社会的エンリッチメントとしても効果をもたらす可能性が示唆された。 第2節では、同種他個体の死亡により単独飼育となったアフリカゾウの成獣メス(36歳)を対象に、その後1年間におけるゾウの日中の行動パターンが、飼育管理の変更によってどのような影響が及ぼされるのか調査した。単独飼育となってから週1回、展示時間中の行動カテゴリーおよび利用場所について1分間隔の瞬間サンプリングで記録し、計52日間のデータを収集した。同時に、管理作業の変更内容についても随時記録した。各観察日における行動発現割合についてクラスター分析を行った結果、行動パターンの特徴から各観察日は5つのクラスター(C1~C5)に分類できた。C1は、全クラスターの中で休息割合の最も高い行動パターンで、他個体が死亡した後および夜間の寝室を変更した後に観察された。C2は、他のクラスターに比べ常同行動の発現割合が最も高く、新奇環境への馴致を開始した後に現れた。また、管理スケジュールが不規則に変更された時にも、常同行動が頻繁に観察された(C2、C4)。対象個体の左後肢に跛行が見られた時期は、休息する傾向の行動パターンが現れた(C3)。C5は活動性が最も高まった行動パターンであり、安定した管理スケジュールの下でなじみの場所を利用することができた時に現れた。以上のことから、社会環境の変化に伴う日常管理の変更は、個体の行動パターンに大きく影響を及ぼすことが明らかとなり、早い段階で管理スケジュールを安定させ、飼育環境内に利用場所の選択肢や採食機会をもたらすことが重要であると考えられた。 本研究は、ゾウを飼育する全国47ヵ所の施設を対象にアンケート方式で実態調査を行ない、その結果を基に、複数の園においてゾウの行動や管理者を含む環境との関係を長期にわたり調査したものである。これにより、飼育下における社会環境や物理的環境は、ゾウの活動性に強く影響を及ぼすことが確認された。また、日常管理におけるゾウの行動学的、生理学的欲求に応じた環境エンリッチメントの実施や、管理者による親和的な関わりも、ゾウの精神的安定や社会性の発揮に寄与する可能性が示された。日本においてゾウの飼育環境を改善するうえで、飼育個体の導入や飼育施設の改修は不可欠であるが、同時に飼育管理を通した福祉的配慮や行動学的知識に基づいたトレーニング技術の構築にも努めることによって、ハードとソフトの両面からゾウの繁殖が可能な飼育環境への発展を目指すことができるだろう。これらのことは、動物園で動物を飼育管理するうえでの基本的な姿勢であるが、その必要性について飼育環境におけるあらゆる側面から科学的に証明し提言することに意義がある。さらに、日常管理や管理者の関わりといった人的要因の福祉的効果を明らかにすることは、ゾウだけでなく全ての展示動物における人と動物の関係性というテーマを扱ううえで重要であることから、今後の動物園における福祉研究の発展に大きく貢献するものと期待される。

著者

田向 健一

出版者

麻布大学

巻号頁・発行日

2014

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The animal trade has aided in pathogen dispersal and has frequently been the cause of pandemics such as SARS, H5N1, avian influenza, and koi herpes. Its effects may be sufficiently significant to cause declines in wild populations as well as serious economic losses around the world. Batrachochytrium dendrobatidis, a fungus which belongs to the Chytridiomycetes class of the Chytridiales order of fungi and which was first described in 1999, causes chytridiomycosis, a disease which infects amphibians. This fungus is responsible for the decline or extinction of more than 20 families and 200 species of amphibians.Abroad, the International Union for Conservation of Nature (IUCN) has designated B. dendrobatidis a pathogen that requires global monitoring and specific study in order to determine its role as a causative factor of chytridiomycosis, and also to evaluate its effects on ecological systems. B. dendrobatidis is also listed in the obligatory Aquatic Animal Health Code published by the World Organization for Animal Health (OIE). The first cases of chytridiomycosis in Asia were confirmed in captive exotic amphibians in Japan by Une et al. (2007), with some of the cases resulting in death. Japan is home to 63 species of amphibians, 40 species of anurans, and 23 species of urodeles, including endemic species. Of these, 42 species (67%) are listed as endangered and near-threatened on the Red List compiled by the Ministry of the Environment of the Government of Japan.B. dendrobatidis has a broad host range, is highly infectious, and has a high fatality rate. B. dendrobatidis zoospores can spread through water and cause infection rapidly over a wide area. To date, however, no studies have sought to determine the prevalence of B. dendrobatidis in imported exotic amphibians in Japan. In addition, the prevalence of B. dendrobatidis in captive amphibians is unknown, and, moreover, treatment methods and elimination techniques for chytridiomycosis have yet to be established for many of the amphibian species at risk of infection.The aim of this study was to survey imported and captive exotic amphibians in Japan in order to determine the prevalence of B. dendrobatidis, and to establish chytridiomycosis treatment and B. dendrobatidis elimination techniques. An additional goal was to decrease the threat of B. dendrobatidis infection in endemic Japanese amphibians.This study consists of three areas of research, described in Chapters 1 to 3, respectively.Chapter 1. B. dendrobatidis Prevalence and Haplotypes in Domestic and Imported Pet Amphibians in Japan.In order to clarify the infection status of B. dendrobatidis, we surveyed amphibians imported into Japan and those held in captivity for a long period or bred in Japan. Between 2008 and 2011, samples were taken from 820 individuals of 109 amphibian species and were analyzed using nested-PCR assays. A total of 76 samples (9.3%) from these 820 amphibians were identified as B. dendrobatidis-positive. Although B. dendrobatidis prevalence was 6.9% (18/259) in sampled amphibians from private collections and those commercially bred in Japan, it was 10.3% (58/561) in imported amphibians. The high prevalence of B. dendrobatidis in imported animals is possibly a result of the increased opportunity for infection due to the high density of individuals in closed environments in the distribution process, particularly breeding facilities, as well as reduced immunity, resulting from the stress of living in an environment different from their natural habitats.Both captive amphibians and those from the pet trade that were surveyed for this study included a significant number of healthy B. dendrobatidis carriers. We identified the genotypes of this fungus using partial DNA sequences of the internal transcribed spacer (ITS) region. Sequencing the PCR products of all 76 B. dendrobatidis-positive samples revealed 11 haplotypes. The species infected with the greatest variety of haplotypes was the Japanese-bred Xenopus laevis, in which haplotypes A, C, Q, and V were detected. This finding supports the contention that Xenopus laevis is a key B. dendrobatidis host species. Whereas five haplotypes, A, C, Q, V and Bd28, were detected in captive Japanese amphibians, the proportion of B. dendrobatidis haplotypes found in samples from Japan differed from that of those from other countries. Haplotype A (DNA Data Bank of Japan accession number AB435211) was found in 90% (52/58) of imported amphibians. Haplotype A is a hypervirulent strain of the global panzootic lineage (Bd-GPL). In contrast, we respectively detected haplotypes C, A, V, Q, and Bd28 in 44%, 28%, 17%, 5.6%, and 5.6% of the sample collected in Japan. On the basis of these results, we determined the diversity of B. dendrobatidis ITS haplotypes in Japan. The exotic amphibians, which had been kept in captivity for a long period of time, would most likely have come into contact with native amphibians during transport and at rearing facilities, allowing the formation of a variety of haplotype phases.Nine B. dendrobatidis haplotypes (A, C, E, L, Q, V, Bd28, Bd38, and Bd41) were detected in amphibians originating from Asia, whereas only three (A, Bd29, and Bd43) were detected in amphibians from outside of Asia. It is clear that Asian amphibians are infected with a high diversity of B. dendrobatidis haplotypes, a fact that supports the “Chytrid out of Asia” hypothesis described by Goka (2009).Chapter 2. Treatment of Spontaneous Chytridiomycosis in Captive Amphibians Using Itraconazole.In Chapter 1, it was mentioned that exotic amphibians imported for the pet trade had a B. dendrobatidis prevalence of 10.3%, and that we confirmed infection and die-off from chyridiomycosis. B. dendrobatidis infects amphibians not only through direct contact but also through B. dendrobatidis zoospores in water, which can cause rapid widespread infection. One particular set of chyridiomycosis-infected amphibians released a large number of zoospore, necessitating the urgent development of treatment methods and elimination techniques for chytridiomycosis.In Chapter 2, we describe the development of an effective, simple, and safe treatment method that targets clinical cases of chytridiomycosis in various amphibian species. The subjects were 12 amphibians (11 anurans of 4 different species and 1 urodela) diagnosed with chytridiomycosis by clinical signs, microscopic findings of shed skin, and a PCR assay. The treatment protocol consisted of a 10-minute immersion in a 0.01% aqueous solution of itraconazole every other day for a total of 7 treatments. We evaluated the efficacy of the treatment using 3 methods: clinical signs, direct microscopy, and a nested-PCR assay. In addition, re-examination was performed to confirm the elimination of chytridiomycosis after treatment (20–57 days, average 34.4 days). As a result, we succeeded in curing 11 of the amphibians of chytridiomycosis and eliminating B. dendrobatidis. Recurrence of chytridiomycosis has not been observed in the past 12 months. This protocol is the first treatment method to cure a caudata of chytridiomycosis. Using the same protocol, coauthor Dr. Une et al. (2012) succeeded in eradicating B. dendrobatidis in a Japanese giant salamander (Andrias japonicus), an endangered species considered to be a special natural monument of Japan. Therefore, we recommend this as a proven treatment method and elimination technique for chytridiomycosis for use in captive amphibians, including caudata.Chapter 3. Efficacy of Copper Ions (Cu2+) for Eradicating B. dendrobatidis : Assessment of Cu2+ on the African Clawed Frog (Xenopus laevis).In Chapter 2, we described the successful development of a method for treating chytridiomycosis in anuran and caudata. Although the medicinal agent used in that research, Itraconazole, is costly when employed to treat humans, it is very effective for treating chytridiomycosis. In the case of amphibians, test animals were placed in small, individual containers, enabling total immersion in the chemical agent and maximizing the cost performance of the medicine.Although this method is well suited for treating terrestrial amphibians, because of the complexity and high cost of managing breeding water, it is not suitable for treating the African clawed frog (Xenopus laevis) or other aquatic amphibians. The African clawed frog is an important laboratory animal that is widely used in biology, genetics, embryology and other fields around the world. The African clawed frog is also an important natural host and carrier of B. dendrobatidis. Indeed, some studies have proposed that the pervasiveness of the African clawed frog may have facilitated the global spread of B. dendrobatidis. As discussed in Chapter 1, B. dendrobatidis was detected in 26.9% of African clawed frogs surveyed and there is currently no established method for eradicating B. dendrobatidis in this species.In this Chapter, we focus on the use of copper ions (Cu2+) as a safe, simple, inexpensive and effective method for eradicating B. dendrobatidis in the African clawed frog. Cu2+ is already used to control bacterial and fungal diseases in fisheries. A previous study demonstrated the application of a 0.006 ppm Cu2+ solution to control Saprolegnia, a fungus which infects fish eggs. Une et al. (unpubl. data) used a B. dendrobatidis strain to examine the effect of Cu2+ on B. dendrobatidis in vitro, and found that 1 ppm of Cu2+ could inhibit fungal growth, while 5 ppm or more could prevent fungal proliferation. We therefore set out to assess the sensitivity of African clawed frogs to Cu2+ and to investigate the application of Cu2+ as means of eradicating B. dendrobatidis. We prepared a copper standard solution for the control group as well as six additional Cu2+ solutions with ion concentrations ranging from 0.02 to 19.68 ppm. The effects of Cu2+ on the African clawed frog were determined by observing physical changes (including changes in the breeding water), measurement of the 50% lethal time (LT50), blood biochemistry, and histopathological examination. No deaths were observed after exposure to the 0.02 ppm Cu2+ solution, one animal died after 239.5 hours of exposure to the 0.21 ppm solution, and half of the animals died after 287.6 hours of exposure to the 0.31 ppm solution; in other words, LT50 and Cu2+ are inversely proportional, with LT50 decreasing as the Cu2+ concentration increases. The optimum Cu2+ concentration of viable African clawed frog is therefore considered to be approximately 0.2-0.3 ppm However, even in the 0.21 ppm group, the breeding water at the end of the experiment was very cloudy due to excessive mucus secretion and/or the presence of sloughed skin. Histopathological examination of the skin revealed acanthosis, mild hyperkeratosis and detachment of the cornified layer in the low Cu2+ concentration group. There were severe changes in skin structure, such as intercellular dissociation accompanied by single cell necrosis, cleft formation between the epidermal cells, and reticular degeneration in the epidermal layer in the high Cu2+ concentration group. These findings indicate that Cu2+ is capable of harming a specimen being treated, even at 0.21 ppm, and that the severity of any damage could be expected to increase with continued exposure.The results described in this Chapter therefore show that Cu2+ concentrations of 0.2 ppm or higher damage the skin of amphibians. At higher concentrations, Cu2+ may cause chemical burns which result in protein denaturation and corrosion of the skin as well as blood electrolyte abnormalities, which result in the damaged skin being unable to function effectively in osmoregulation. Blood enzyme activities will also increase dramatically as the Cu2+ concentration increases and the solution becomes toxic. Thus, these findings show that Cu2+ is not well suited for eradicating B. dendrobatidis. However, Cu2+ can inhibit the proliferation of Saprolegnia at 0.006 ppm and Vibrio bacteria at 0.1 ppm. Culturing B. dendrobatidis is very difficult and establishing the first strain in Japan took one year. The reason it was so time-consuming was because bacteria from the surface of the frog skin could not be removed from the culture medium. However, it may now be possible to supplement the culture medium with Cu2+ and create a selective medium for B. dendrobatidis.We have clarified the extent of B. dendrobatidis infection in amphibians introduced to Japan from abroad using a molecular biology approach, and have established a method for treatment and eliminating spontaneous chytridiomycosis. The findings from this research now provide us with a method for preventing the proliferation of B. dendrobatidis in captive amphibians and show promise for developing medical treatments for wild amphibians threatened by chytridiomycosis.

著者

宇根 ユミ 共田 洋

出版者

麻布大学

雑誌

基盤研究(C)

巻号頁・発行日

2015-04-01

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本研究は、両生類の新興病原体であるカエルツボカビ(Bd)が在来種に与える影響を宿主と寄生体の双方を解析・評価し「なぜ日本の両生類は死なないのか」その機序解明を目的とする。その結果、ITS-1領域の違い基づくBdハプロタイプごとに、その形状、増殖態度および病原性が異なり、国内では弱毒性Bdを主流とした多種類のハプロタイプのBdが自然界で維持されていることを明らかにした。免疫抑制モデルを用いた感染実験で、一過性の不顕性感染であったことから、在来種のBd抵抗性には免疫以外の生体防御機構も働いている可能性が示唆された。また、ツボカビ症でみられる電解質の変化は皮膚の水透過性異常に起因するものと推察した。

著者

高瀬 有加里

出版者

麻布大学

巻号頁・発行日

2005

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雌性生殖(gynogenesis)は、卵成熟過程において減数分裂をすることなしに卵を形成し、胚の発生に精子の刺激を必要とするものの、その精子核ゲノムと卵は融合しない。そのため、子供は母親と遺伝的に同一で、クローン発生といえる。雌性生殖は単性生殖のひとつであり、精子を必要とせずに胚が発生する単為生殖(parthenogenesis)や、卵成熟過程において、片方の親由来のゲノムのみが排除され、通常の受精を行って発生する雑種発生(hybridogenesis)と異なる。 1932年にHubbsらによって、Amazon Molly(Poecilia formosa)が雌性生殖を行う魚として最初に発見され、それ以降、世界中には約17種類の雌性生殖を行う魚がいると言われている。そのうち、日本には3倍性ギンブナ(Carassius auratus langsdorfi)とドジョウ科の一部が棲息しているにすぎない。このような生殖機構は脊椎動物では大変珍しく、通常の有性生殖を理解する上で、その細胞学的、遺伝学的解明に関心がもたれる。ギンブナには雌性生殖を行う3倍性個体以外に、有性生殖を行う2倍体個体も存在する。したがって、ギンブナは雌性生殖機構と有性生殖機構を比較するのに適したモデルとなる。本研究では、雌性生殖機構の解明を目指す一環として、3倍性ギンブナゲノムの遺伝学的特徴を調べるため、以下の2つのアプローチを行った。 第一章 キンギョ(和金:Carassius auratus auratus)のミトコンドリアDNAの全塩基配列決定および日本産フナと大陸産フナの系統学的関係について 日本のギンブナ(C. a. langsdorfi)は、コイCyprinidae科コイCyprininae亜科Carassius auratusに属し、この中にはギンブナの他に4つの亜種、ゲンゴロウブナ(C. a. cuvieri)、ナガブナ(C. a. burgeri)、ニゴロブナ(C. a. grandoculis)、キンブナ(C. a. subsp.)が存在する。またユーラシア大陸にはギベリオブナ(C. a. gibelio)が、中国には中国普通鮒(C. a. auratus)が知られている。 本研究では、中国普通鮒を祖先とすると言われているキンギョ(和金:C. a. auratus)のミトコンドリアDNA(以下mtDNA)の全塩基配列を決定し、既に報告されている3倍性ギンブナ、ゲンゴロウブナのmtDNAの全塩基配列と比較することから、その系統学的関係を明確にした。3倍性ギンブナ、ゲンゴロウブナのmtDNAの塩基配列からキンギョの全mtDNAを増幅する11種類のプライマーを設定した。続いて、プライマーウォーキング法により、40種類のシークエンシング用プライマーを作製し、塩基配列の決定を行った。キンギョmtDNAの全長は16,580bpであり、その遺伝子構成は既報告のコイやゲンゴロウブナ、3倍性ギンブナのものと同じであった。各遺伝子コード領域の塩基配列をゲンゴロウブナ、3倍性ギンブナと比較した結果、キンギョはゲンゴロウブナより3倍性ギンブナに近いものであった。これは、以前に報告されているD-loop領域の解析による結果と一致した。mtDNAの遺伝子領域においても、3倍性ギンブナとキンギョの系統学的関係はゲンゴロウブナよりも近いものであることが示唆された。 また、日本産フナと大陸産フナの関係を詳細に調べた。日本産フナ4亜種、大陸産フナ2(亜)種とキンギョ(和金と青文金)におけるmtDNA上のNADH5遺伝子とチトクロームb遺伝子コード領域の塩基配列を用いて系統樹を作成した。その結果、オランダで採取されたフナが最初に分岐し、次にゲンゴロウブナが分かれ、その後に、日本に分布しているその他の亜種と大陸に分布している亜種の2つに分岐した。さらに、大陸産フナはギベリオブナと中国普通鮒の2つのクラスターに分かれ、キンギョは中国普通鮒のクラスターに属した。これは、キンギョが中国普通鮒を祖先とするという説を支持するものである。日本の3倍性ギンブナは2倍体ギンブナを母系起源とし、一部はギベリオブナに遺伝的に近い大陸のフナ集団を母系起源とした。このことは、mtDNAのD-loop領域の解析においても指摘されており、今回、遺伝子コード領域においても確認できた。 第二章 AFLP解析による3倍性ギンブナに特異的なゲノムマーカーの探索 増幅断片長多型(amplified fragment length polymorphism:AFLP)解析を利用して、3倍性ギンブナを識別するゲノムマーカーの探索を行った。AFLP解析は新しいDNAフィンガープリント法で、ゲノムDNAを制限酵素で切断し、その断片をPCR法により選択的に増幅する。この方法を用いて、3倍性ギンブナ(3尾)と2倍体ギンブナ(2尾)のゲノムDNAを比較し、3倍性ギンブナに特異的なDNAマーカーを探索した。得られたマーカーの存在を多くの個体について解析し、3倍性ギンブナのゲノム構成および起源について考察した。 AFLP解析産物をポリアクリルアミドゲルによって電気泳動し、3倍性ギンブナに特有と思われる14種類のDNA断片を得た。これらのクローニングを行って塩基配列を決定した。DNAデータベースとの相同性検索の結果、その配列はどれも遺伝子コード領域を含まず、ゲノムDNA上のジャンク(がらくた)配列と思われた。14種類の塩基配列に対して17対のプライマーを作製し、3倍性ギンブナ43尾、2倍体ギンブナ10尾、さらにギンブナ以外の日本産フナ4亜種、大陸産フナ2亜種とキンギョの計18尾についてPCRを行った。その結果、17対のプライマーのうちの、Y2-2プライマーとY2-16プライマーの2対のプライマーにおいて、3倍性ギンブナに特徴的な増幅産物が確認できた。 Y2-2プライマーによるPCRでは、多くの3倍性ギンブナにおいて300bpと350bpの2つのバンドが見られたのに対し、2倍体ギンブナは350bpバンド(1尾を除く)の、ギベリオブナは300bpバンドのそれぞれ単一のバンドであった。これらの塩基配列を解析したところ、3倍性ギンブナの300bpと350bpの2本のバンドは、それぞれギベリオブナの300bpバンドおよび2倍体ギンブナの350bpバンドと一致した。このことは、3倍性ギンブナの多くが、2倍体ギンブナとギベリオブナに由来するDNAから構成されていることを示唆した。また、ゲンゴロウブナ、ナガブナ、キンブナにも単一の300bpバンドが認められたが、ギベリオブナの300bpバンドとは塩基配列が異なっていた。一部の3倍性ギンブナは300bpのみのバンド、または350bpのみのバンドを示した。300bpバンドのみが見られた3倍性ギンブナは複数個体あり、ギベリオブナの300bpバンドと同一の配列である個体と、他の日本産フナの300bpバンドに近い配列を持つ個体が存在した。一方、350bpバンドのみが見られた3倍性ギンブナのバンドは2倍体ギンブナの350bpバンドと同一の配列であった。これらの事実は、3倍性ギンブナのゲノム起源が複数あることを示唆している。 Y2-16プライマーによるPCRにおいて、ほとんどの3倍性ギンブナは250bpバンドと270bpバンドの2つが見られ、一方、2倍体ギンブナは250bpバンドのみであり、ギベリオブナは260bpバンドと270bpバンドの2つが見られた。また、ゲンゴロウブナ、中国普通鮒は260bpバンドのみが認められ、キンブナでは増幅が見られなかった。それぞれのバンドの塩基配列を解析した結果、3倍性ギンブナの250bpバンドは2倍体ギンブナの250bpバンドと100%一致しており、270bpバンドはギベリオブナの270bpバンドと99.2%の相同性を持つものであった。したがって、3倍性ギンブナの多くは2倍体ギンブナとギベリオブナに由来するDNAを持つと考えられた。一部の3倍性ギンブナには260bpバンドのみを持つ個体が存在した。これには、ギベリオブナの260bpバンドと塩基配列が完全に一致している個体と、そうではない個体が存在した。ギベリオブナと同一の配列の260bpバンドのみが見られる3倍性ギンブナのゲノムは、ギベリオブナに由来すると考えられた。一方で、異なる配列の260bpバンドのみが見られる3倍性ギンブナは、ギベリオブナ以外のフナに由来することが示唆されたが、その起源について本研究で明らかにすることはできなかった。Y2-2プライマーによる結果と同様に、3倍性ギンブナの多起源が示された。 本研究でのmtDNAの遺伝子領域とAFLPマーカーによる解析から、国内の3倍性ギンブナの多くは2倍体ギンブナとギベリオブナの雑種起源であるとした説を支持した。この大多数を占める3倍性ギンブナ集団は、母性遺伝するmtDNAの解析から、母系起源は2倍体ギンブナであり、またAFLPマーカーの解析を組み合わせると、父系起源は大陸産のフナであるギベリオブナと考えられた。一方で、少数ではあるが、母系起源および父系起源ともに、大陸産フナ(おそらくギベリオブナ)のみに由来する3倍性ギンブナも見られた。また2倍体ギンブナから産まれたと思われるものや、ギンブナ以外の日本産フナから産まれたと思われる3倍性ギンブナの存在も示唆された。その詳しい起源について本研究では明確にできなかった。このように、3倍性ギンブナの起源は単一ではなく複数あることが考えられる。 日本のほとんどの3倍性ギンブナがギベリオブナ由来のゲノムを保持しており、雌性生殖能とギベリオブナゲノムとの関係が重要であると思われる。今後は、ギベリオブナゲノムの詳細な解析と、3倍性ギンブナに特異的な数多くのゲノムマーカーを利用して、雌性生殖に関与するゲノム因子の探索を行なうことで、雌性生殖機構の解明に近付くのではないかと思われる。

著者

相馬 武久

出版者

麻布大学

巻号頁・発行日

2001

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Along with a recent trend to characterize pet dog as companion animal, further improvement has been required in veterinary medicine based essentially on an accurate diagnosis. Regarding the diagnosis of infectious diseases, neutralizing test (NT) is the most reliable antibody test widely used; however, due to disadvantages in lacking rapidity, simplicity and economic efficiency, the test is not suitable for routine laboratory practice. Hemagglutination inhibition (HI) test provides simplicity along with the specificity equivalent to that of the NT, yet it is only applicable to detect viruses demonstrating hemagglutination activity. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has recently been demonstrated as a simple and accurate detecting method and is currently utilized most frequently in the field of veterinary medicine. However, because of the non-specific reactions, ELISA sometimes yields an ambiguous result to determine. Immunoperoxidase plaque staining (IP) test was demonstrated in 1982 to compensate for the defect associated with ELISA. In this enzyme antibody technique, plaque, a cluster of virus-infected cells, is used as an antigen and raised in a testing well concomitantly with an uninfected cell layer, providing readily distinguishable appearance of non-specific reactions. The test procedures are similar to those of ELISA. In this study, to examine the diagnostic application of the IP test to canine virus infections, we established antibody test systems for canine distemper virus (CDV), canine coronavirus (CCoV) and canine herpesvirus (CaHV), in which the HI test is less applicable, and examined the possibility to apply the system to the field of canine practice. The epidemiological surveys on these viruses in Japan have not yet been completed; therefore, we conducted the field studies to examine the prevalence of antibodies to these viruses using the IP test.1. Establishment of antibody test system by IP test First, conditions of antigen plates were examined to establish a diagnostic system with the IP test. Vero, CRFK and A-72 cells, which provided clearly observable plaque, were used for cell culture in the CDV-, CCoV- and CaHV-IP tests, respectively. These were infected with each virus at titers of 30 plaque forming units (PFU)/well, providing an appropriate viral density per well for easy observation. The infected cells were incubated for 40 hours on a methylcellulose underlay to support plaque formation and to simplify subsequent operations, followed by fixation with ethanol and these plates were used for the antibody test. For determination, the wells were stained with o-dianisidine to reveal plaque. A test sample was determined positive when brown-colored plaques were observed. The highest serum dilution showing this color development was regarded as IP titer. The color reaction given by the plaques was clear, even when some color developed on uninfected cells in the background owing to non-specific reactions, because the coloration of the plaques was much stronger. We also examined the influences of long-term storage and lot-to-lot variation on the quality of the IP antigen plates. The antigen titers for CDV, CCoV and CaHV were well preserved in the IP plates stored in -20℃ for six months after the production, and were not affected by lot-to-lot variation. These results demonstrate that the IP test constantly provides stable antibody determination.2. Specificity of IP test The specificity of the IP tests was examined by exposing the CDV-, CCoV- and CaHV-IP antigen plates to antisera containing several antibodies against canine viruses. There were no cross-reactions with the antisera in each IP plate, indicating that the IP test specifically detects the target antibody.3. Application of IP test to CDV3-1. Antibody responses of CDV-vaccinated SPF dogs When the antibody response was examined in 84 specific pathogen-free (SPF) dogs that had received CDV vaccine and 30 unimmunized SPF dogs, all the sera from unimmunized SPF dogs that had negative NT titers showed negative IP titers. All the sera from the vaccinated SPF dogs that had positive NT titers showed positive IP titers. There was a strong correlation between the IP and NT titers (r=0.953). The regression line was as follows: y= 0.884x-0.252. Then, when 12 SPF dogs were inoculated with CDV vaccines, both titers followed a similar course after the inoculation in all the dogs. These findings indicate that the IP test has specificity similar to that of the NT. Based on the above regression line, an NT titer of 1:32, which was estimated as a criterion for defensive ability against canine distemper (CD), was then converted into an IP titer of 1:160 to establish the evaluation criterion for the IP test.3-2. Prevalence of antibody in companion dogs The IP test was used to investigate the prevalence of the antibody in sera from 584 healthy dogs. The percentages of sera that had positive IP titers (≧1:10) and that reached the criterion (≧1:160) were 76.5% and 62.5% of all sera tested, respectively. These percentages tended to decline in dogs aged over 9 year. In particular, a marked decrease was observed in the percentage of those reaching the criterion for defensive ability. Aging has recently been progressing so rapidly in the pet community that an increased concern has been raised about the age-related impaired immune system. Our results confirmed this age-related problem and emphasized the need for an aged dog to undergo regular antibody testing and appropriate vaccination based on the result. The results also demonstrated that the IP test was extremely suitable for examining a large number of samples, for instance, in the case of medical checkup.3-3. Comparison of IP test and NT in companion dogs The antibody titers were investigated in 50 healthy dogs and 186 suspected cases of CD (107 dogs showed neurological signs and 83 dogs did not). AII the sera that had positive NT titers showed positive IP titers, and all the sera that had negative NT titers showed negative IP titers in the healthy dogs. In contrast, 71.7% and 65.5% of the sera that had negative NT titers showed positive IP titers in the suspected cases of CD with and without neurological signs, respectively. Hence, the IP test was clearly demonstrated as an effective antibody test for the diagnosis of CD.3-4. Estimation of IP-NT score Furthermore, we examined a possible diagnostic index in terms of the IP titer. The difference between IP and NT titers (IP-NT score) was estimated in the healthy dogs and the suspected cases of CD. The score was indicated as the mean±SD; that is, 0.616±0.385 in the healthy dogs, 1.631±0.834 in the suspected cases of CD with neurological signs and 1.348±0.837 in the suspected cases of CD without neurological signs, resulting in a significantly increased score in the suspected cases of CD (p<0.01). Based on this result, we analyzed the mean±3SD, which 99% of the samples tested are within, and determined the upper limit (mean+3SD) for the healthy dogs as 1.8 of IP-NT score. This upper limit was exceeded in 41.4% of the suspected cases of CD with neurological signs and 31.5% of the suspected cases of CD without neurological signs, indicating that an IP-NT score of > 1.8 is available as one of the diagnostic indices. In a follow-up study conducted on 15 dogs displaying an IP-NT score of > 1.8 at the first examination, 12 of 15 dogs developed neurological signs within one month. These results suggest that the IP-NT score is useful for predicting the onset of neurological signs as well as for diagnosing CD.4. Application of IP test to CCoV4-1. Changes in antibody titers in CCoV-experimentally infected SPF dogs When 3 SPF dogs that were inoculated with CCoV, IP and NT titers followed a similar course after the inoculation.4-2. Comparison of IP test and NT in companion dogs A comparison between the IP test and the NT was performed on 240 healthy dogs and 187 diarrheic dogs (115 dogs aged under one year and 72 dogs aged over one year). All the sera that had negative NT titers showed negative IP titers and all the sera that had positive NT titers showed positive IP titers in the healthy dogs. In contrast, 20.3% and 2.1% of the sera that had negative NT titers showed positive IP titers in the diarrheic dogs aged under one year and aged over one year, respectively. Hence, the IP test should be useful for the diagnosis of CCoV-infection.4-3. Estimation of IP-NT score The score was indicated as the mean±SD; that is, 0.982±0.447 in the healthy dogs, 2.350±0.931 in the diarrheic dogs aged under one year and 1.404±0.896 in the diarrheic dogs aged over one year, resulting in significantly increased scores in the diarrheic dogs (under one year; p<0.01, over one year; p<0.05). The upper limit (mean+3SD) for the healthy dogs was 2.3 of IP-NT score. This upper limit was exceeded in 57.1% of the diarrheic dogs aged under one year and 24.0% of the diarrheic dogs aged over one year, indicating that an IP-NT score of > 2.3 is available as one of the diagnostic indices for CCoV-infection.4-4. Prevalence of antibody in companion dogs The percentages of the sera which had positive IP titers were 25.0%, 48.7% and 34.7% in 240 healthy dogs, 115 diarrheic dogs aged under one year and 72 diarrheic dogs aged over one year, respectively. The percentage of the diarrheic dogs under one year of age was significantly higher than that of the healthy dogs (p<0.01), indicating that CCoV contributes to diarrhea in many juvenile dogs. Further analysis was performed to determine the prevalence of CCoV antibody in the diarrheic dogs with or without anti-canine parvovirus (CPV)-IgM antibody. CCoV-antibodies were identified in 38.1% of sera positive for CPV-IgM antibody and in 62.2% of those negative for the IgM, the latter being significantly higher than the former (p<0.05) as well as that in the healthy dogs (p<0.01). This suggests that the antibody test for CCoV should be performed concurrently with that for CPV when diagnosing diarrhea in dogs.5. Application of IP test to CaHV5-1. Comparison of IP test and NT in laboratory and companion dogs A comparison between the IP test and the NT was performed on 53 dogs from a CaHV-contaminated laboratory, 590 healthy dogs and 35 dogs with chronically respiratory signs. In these animals, all the sera that had positive NT titers showed positive IP titers; however, 23.8%, 0.5% and 3.5% of each group, which had negative NT titers, showed positive IP titers, implying that the IP test detects the antibody more accurately than the NT. The results indicate that the IP test is highly applicable to the serodiagnosis of CaHV-infection.5-2. Estimation of IP-NT score The IP-NT score was indicated as the mean±SD; that is, 1.280±0.520 in the laboratory dogs, 1.220±0.441 in the healthy dogs and 1.106±0.334 in the dogs with respiratory signs. There were no significant differences among the laboratory dogs, the healthy dogs and the dogs with respiratory signs.5-3. Prevalence of antibody in companion dogs Investigation of CaHV-antibody in sera from 590 healthy dogs demonstrated an extremely low prevalence, that is, 3.1%. However, the prevalence in 35 dogs with chronically respiratory signs was estimated to be 20.0%, and was significantly higher than that of the healthy dogs (p<0.01). The result was consistent with a general tendency concerning the relationships between CaHV and respiratory diseases.6. Prevalence of antibody in multi-dog households Additionally, we analyzed the prevalence of CCoV- and CaHV-antibody in mass-breeding environments. CCoV-antibodies were identified in 100%, 100%, 90.0%, 0% and 0% of the respective samples from 5 breeding facilities; the percentages in the 3 facilities exceeded that of the healthy dogs (p<0.01). CaHV-antibodies were identified in 100%, 69.8%, 0% and 0% of the respective samples from 4 breeding facilities; the percentages in the 2 facilities exceeded that of the healthy dogs (p<0.01). These results imply that once CCoV and CaHV contaminate a mass-breeding facility, they spread extensively and the antibodies are detected in a considerable percentage of animals. Therefore, prior to the transportation and intermixing of dog populations, CCoV- and CaHV-infections should be examined using the IP test. In this study, the IP test was used for the first time to diagnose canine virus infections, indicating its high specificity as well as simplicity and rapidity compared to those of the conventional NT and ELISA. We established a useful diagnostic method for CDV and CCoV infections using a combination of IP test and NT. No such information has previously been reported. Furthermore, we demonstrated the prevalence of the CDV-, CCoV- and CaHV-antibodies in the pet population, which has not previously been thoroughly investigated in Japan. Taken together, these results suggest that the IP test is highly applicable to the diagnosis of canine virus infections.

著者

田中 恵美 榊原 康江 髙橋 真 齋藤 俊夫 立道 佳哲 杉山 貴浩

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

vol.26, pp.68-69, 2015-03-20

著者

田村 勝利 小田切 時彦 真船 直人 田村 輝美 齋藤 弥代子

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

no.15, 2008-03-31

著者

松井 久実

出版者

麻布大学

雑誌

若手研究(B)

巻号頁・発行日

2004

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本研究は、表皮の色素細胞に高濃度のカロテノイドを蓄積するイモリを用いて、彼らの蓄積能力と餌資源中のカロテノイドとの関係について解析するものである。1)イモリのカロテノイド蓄積能力について変態後3年を経過したイモリ幼体40匹を4群に分け、アスタキサンチン、B-カロテン、ルテインのスタンダードを2ヶ月間に渡り計20mgを強制経口投与し、実験終了後各組織を採材、冷凍保存した。この投与条件では皮膚の赤色化は認められなかった。HPLCを用いて、特にカロテノイドが含まれる腹側皮膚と肝臓についてカロテノイド組成と量を解析したところ、アスタキサンチン投与群の腹側皮膚からは高いアスタキサンチンピークと低いエキネノンピーク、肝臓からは低いアスタキサンチンピークと高いエキネノンピークが検出された。この結果に個体差は見られず、かねてより報告されているカロテノイドの組織特異性が改めて示唆された。腹側皮膚のカロテノイド量には個体差が見られた。2)餌資源中のカロテノイドについてイモリ幼体が餌としているのは、土壌中の中型土壌動物と呼ばれる一連の動物群である。その中でもイモリはトビムシやダニを摂食している。ツルグレン法で抽出した土壌動物サンプルのHPLCを行ったところ、明瞭なカロテノイドピークは確認できず、MSの併用かサンプル量の増量の必要があると考えられた。

著者

高槻 成紀

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

vol.19/20, pp.139-147, 2010-03-31

著者

森田 英利 坂田 亮一 加藤 行男 久松 伸

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

vol.5/6, pp.176-181, 2003-03-31

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亜硝酸ナトリウム(NaNO_2),塩化ナトリウム(NaCI)あるいは数種類の抗生物質で処理したベロトキシン産生大腸菌(VTEC)O157:H7の3株から,ベロトキシン(VT)1型と2型の放出量を定量した。VTEC O157:H7のうち,2株がVT1型とVT2型の両者を産出し,1株がVT2型のみ産出した。VTEC O157:H7をNaNO_2(最少発育阻止濃度である6,000mg/L)で処理したがVT1型およびVT2型の放出量は増加しなかった。NaNO_2由来の一酸化窒素(NO)の抗菌メカニズムを明らかにするために,NaNO_2で処理したVTEC O157:H7の細胞を77Kでの電子常磁性共鳴吸収(EPR)法に供した。その結果,g値2.035と2.010のEPRシグナルを検出し,細胞内に鉄硫黄タンパク質とNOが反応して形成されたジニトロシル鉄硫黄錯体が存在した。またATPの合成も阻害されていた。このことから,NaNO_2出来のNOは細胞内に入り,呼吸鎖に関与する酵素を不活化したものと考えられた。

著者

落合 偉洲

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

vol.26, 2015-03-20

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

vol.26, 2015-03-20

著者

大仲 賢二 古畑 勝則 福山 正文

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

vol.13, pp.241-247, 2006

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Vibrio vulnificus感染症の感染経路や感染源を解明する一環として,環境由来株とヒト臨床由来株について血清型別,各種抗菌剤の薬剤感受性試験およびPFGE法によりDNA解析を行い分子疫学的検討を行ったところ,以下の成績が得られた。1.由来別に血清型を検討したところ,環境由来では72.5%が18菌型に型別され,O7が43.1%と最も多く,次にO4が6.1%などであった。ヒト臨床由来では87.1%が8菌型に型別され,O4が43.5%と最も多く,次にO7が12.9%などであった。その地域別において,東日本地域では69.2%が18菌型に型別され,O7が44.6%,04が5.7%などに,西日本地域では64.8%が8菌型に型別され,O7が20.4%と最も多く,次にO4が11.1%などにそれぞれ型別された。2.由来別に薬剤感受性をMIC_<90>で比較検討したところ,環境由来ではABPC,PIPC,CPZ,CTX,LMOX,MEPM,GM,EM,TC,DOXY,MINO,CP,NAおよびCPFXに感受性を示したが,CER,CET,CTX,CMZ,KMおよびLCMに対して耐性株が認められた。ヒト臨床由来ではEM,TC,DOXY,MINO,CP,NAおよびCPFXに感受性を示したが,ABPC,PIPC,CER,CET,CPZ,CTX,CMZ,LMOX,MEPM,KM,GM,AMKおよびLCMに対して耐性株が認められた。3.Not IとSfi Iの2種類の酵素を用いてそれぞれDNA切断を行い,PFGE法でDNA解析を検討したところ,酵素別のDNAパターン判読率は,Not I では76.9%,sfi Iでは97.9%を示し本菌のDNAパターン判読率はSfi Iが優れていた。4.Sfi IによってDNAパターンが判読された菌株をUPGMA法で解析を行ったところ,類似度が低く多岐のクラスターを示し,本菌感染症は複数のクローンから発生していることが明らかとなった。また,由来等が異なるが類似度が89%以上の類似度で,臨床株と環境株の組合せが認められることから,環境からヒト,ヒトから環境への感染の可能性が考えられた。

著者

大仲 賢二 古畑 勝則 福山 正文

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

vol.13/14, pp.241-247, 2007-03-31

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Vibrio vulnificus感染症の感染経路や感染源を解明する一環として,環境由来株とヒト臨床由来株について血清型別,各種抗菌剤の薬剤感受性試験およびPFGE法によりDNA解析を行い分子疫学的検討を行ったところ,以下の成績が得られた。1.由来別に血清型を検討したところ,環境由来では72.5%が18菌型に型別され,O7が43.1%と最も多く,次にO4が6.1%などであった。ヒト臨床由来では87.1%が8菌型に型別され,O4が43.5%と最も多く,次にO7が12.9%などであった。その地域別において,東日本地域では69.2%が18菌型に型別され,O7が44.6%,04が5.7%などに,西日本地域では64.8%が8菌型に型別され,O7が20.4%と最も多く,次にO4が11.1%などにそれぞれ型別された。2.由来別に薬剤感受性をMIC_<90>で比較検討したところ,環境由来ではABPC,PIPC,CPZ,CTX,LMOX,MEPM,GM,EM,TC,DOXY,MINO,CP,NAおよびCPFXに感受性を示したが,CER,CET,CTX,CMZ,KMおよびLCMに対して耐性株が認められた。ヒト臨床由来ではEM,TC,DOXY,MINO,CP,NAおよびCPFXに感受性を示したが,ABPC,PIPC,CER,CET,CPZ,CTX,CMZ,LMOX,MEPM,KM,GM,AMKおよびLCMに対して耐性株が認められた。3.Not IとSfi Iの2種類の酵素を用いてそれぞれDNA切断を行い,PFGE法でDNA解析を検討したところ,酵素別のDNAパターン判読率は,Not I では76.9%,sfi Iでは97.9%を示し本菌のDNAパターン判読率はSfi Iが優れていた。4.Sfi IによってDNAパターンが判読された菌株をUPGMA法で解析を行ったところ,類似度が低く多岐のクラスターを示し,本菌感染症は複数のクローンから発生していることが明らかとなった。また,由来等が異なるが類似度が89%以上の類似度で,臨床株と環境株の組合せが認められることから,環境からヒト,ヒトから環境への感染の可能性が考えられた。

著者

服部 正平 森田 英利

出版者

麻布大学

雑誌

麻布大学雑誌 = Journal of Azabu University (ISSN:13465880)

巻号頁・発行日

vol.27, pp.59-60, 2016-03-31

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メタゲノムからヒト常在菌叢の生態と機能を読み解く