4 0 0 0 OA バキュロウイルスを用いた哺乳動物細胞への遺伝子導入とその応用
3 0 0 0 OA 世界ポリオ根絶計画から学ぶ感染症コントロールの根本
- 著者
- 宮村 達男
- 出版者
- 日本ウイルス学会
- 雑誌
- ウイルス (ISSN:00426857)
- 巻号頁・発行日
- vol.59, no.2, pp.277-286, 2009-12-24 (Released:2010-07-03)
- 参考文献数
- 28
- 被引用文献数
- 1 1
ウイルス感染症との戦いの歴史において,人は天然痘の根絶という金字塔を打ち立てた1).そして(i)病気を正しく知り,おそれる,(ii)伝播様式など病原体の性状を正しく知る,(iii)安全で有効なワクチンを持つ,(iv)正確で迅速なサーベイランスと新しい科学的知見に基づく機敏な戦略をたてることが感染症コントロールの基本であることを知った.ポリオは既にSalk不活化ワクチン2),Sabin生ワクチン3)によって先進諸国ではほぼ完全にコントロールされていたが,World Health Organization(WHO)は1988年,果敢にも6つのワクチンによる予防可能疾患の筆頭として世界ポリオ根絶計画をスタートさせた.
- 著者
- 上司 裕史 原田 英治 大林 明 矢倉 道泰 福田 彰 片山 透 岡 輝明 市川 光洋 宮村 達男
- 出版者
- 一般社団法人 日本肝臓学会
- 雑誌
- 肝臓 (ISSN:04514203)
- 巻号頁・発行日
- vol.32, no.3, pp.235-242, 1991
慢性肝疾患(CLD),肝細胞癌(HCC)の550例についてHCV抗体をEIA法により測定し,成因別検出頻度をみた.NANB型では輪血歴の有無にかかわらず,きわめて高率(74%,225/306)に検出された.B型では9% (8/88)であったが,陽性者の大半に輸血歴があった.アルコール多飲者のCLDでは,輸血歴のある症例を除いても比較的高率(20%, 10/51)であった.しかし,断酒後のASTの推移と,肝生検像からアルコール性CLDと診断された症例群での検出率は低かった(6~7%).多飲歴をもつHCCでは高率(59%, 20/34)で,NANB型HCC (67%, 28/42)との間に有意差を認めなかった.この知見から,多飲者CLDからの発癌の大部分にもHCV感染の関与していることが示唆された.なお,補足的観察としてアルコール依存症についてHCV抗体を測定し,8% (4/48)とやや高い検出率をえた.
1 0 0 0 チンパンジーとハンセン病
- 著者
- 石井 則久 鵜殿 俊史 藤澤 道子 伊谷 原一 谷川 和也 宮村 達男 鈴木 幸一
- 出版者
- 日本ハンセン病学会
- 雑誌
- 日本ハンセン病学会雑誌 = Japanese journal of leprosy (ISSN:13423681)
- 巻号頁・発行日
- vol.80, no.1, pp.29-36, 2011-02-01
- 参考文献数
- 25
- 被引用文献数
- 1
Leprosy is suspected to develop after a long period of latency following infection with <i>Mycobacterium leprae</i> (<i>M. leprae</i>) during infancy, but definitive proof has been lacking. We found a rare case of leprosy in a chimpanzee (<i>Pan troglodytes</i>) born in West Africa (Sierra Leone) and brought to Japan around 2 years of age. At 31, the ape started exhibiting pathognomic signs of leprosy. Pathological diagnosis, skin smear, serum anti-phenolic glycolipid-I (PGL-I) antibody, and by PCR analysis demonstrated lepromatous leprosy. Single-nucleotide polymorphism (SNP) analysis verified the West African origin of the bacilli. This occurrence suggests the possibility of leprosy being endemic among wild chimpanzees in West Africa, potentially posing a zoonotic risk.
1 0 0 0 OA 野生株ポリオウイルスの実験室封じ込めに関するWHO世界的行動計画 第2版
- 著者
- 清水 博之 吉田 弘 宮村 達男
- 出版者
- 日本ウイルス学会
- 雑誌
- ウイルス (ISSN:00426857)
- 巻号頁・発行日
- vol.55, no.1, pp.161-178, 2005 (Released:2005-11-22)
- 参考文献数
- 39
本稿は,WHO global action plan for laboratory containment of wild polioviruses (Second edition) の全訳である.天然痘やSARSコロナウイルスの例を挙げるまでもなく,実験室に由来する感染症流行の社会的リスクは,きわめて現実的な問題である.野生株ポリオウイルス根絶が間近となり,ポリオワクチン接種停止について議論されている現在,野生株ポリオウイルスの実験室封じ込めについても具体的な行動が求められている.日本語訳作成の主たる目的のひとつは,必ずしも周知されていないポリオウイルス野生株の定義や実験室封じ込めの基準に関する現時点におけるWHO指針を明確にすることにある.同時にまた,感染症以外の広範な施設がポリオウイルスを保有する可能性について,担当者に理解していただくための基本的資料を提供することを目的としている.
1 0 0 0 野外株の遺伝子解析によるポリオウイルスの生態学
- 著者
- 宮村 達男 吉田 弘 清水 博之 PHAN Van Tu 米山 徹夫 萩原 昭夫 松浦 善治 武田 直和 RADU Crainic DELPEYROUX F CRAINIC Radu
- 出版者
- 国立感染症研究所
- 雑誌
- 国際学術研究
- 巻号頁・発行日
- 1996
ポリオウイルスは代表的なエンテロウイルスであり、経口感染によりヒトからヒトへと伝播する。そしてヒトのみが唯一の感受性自然宿主である。糞口感染が日常的におこらないような衛生状態が恒常的に保たれれば、ポリオの伝播は次第に絶ち切られ、ポリオという疾患は消滅するはずである。一気にポリオを根絶する為には、更に強力な免疫計画とサーベイランスが必要であり、この目的をもって世界レベルの根絶計画がWHOの強力な指導のもとにスタートした。我が国の属する西太平洋地域では野生株ポリオウイルスは激減しているが、本研究は最後までウイルスが残っているベトナムをその対象領域として、野生株ポリオウイルスが弱毒性ワクチン株に置き換えられてゆく最後の過程を検証することにある。1997年、ベトナムでは1例、隣国のカンボジアでは8例の野生株が分離された。これらは現地で急性弛緩性マヒ(Acute Flaccid Paralysis:AFP)を生じた小児の糞便検体が当研究室に送付され、ウイルス分離、同定、型内鑑別が行われたものである。そしてこれらの分離株のVP-1領域の塩基配列を決定し、これまで周囲で分離されていた野生株と比較した。その結果、インドシナ半島で複数存在していた株のうちの一つのみが残っていることがわかった。北ベトナムでAFP例から分離されたウイルスは、ここ2年間、すべてワクチン由来株であったが、この1年はワクチン株の分離も減少している。一方、南ベトナムの国家ラボで得られた成績と日本のラボでの成績には、一部不一致がみられた。その問題点を解決する手段として、野本らにより樹立されたポリオウイルスのレセプターを発現しているマウス細胞株(Lα細胞)を用いた、ポリオウイルス選択的なウイルス分離が提唱され、実行されつつある。かくして、1997年3月19日のカンボジアの1例を最後として、野生株は分離されておらず、これが最後の例となるか、更なる強力な監視が必要である。
1 0 0 0 非A非B型肝炎起因因子の同定
- 著者
- 宮村 達男 宮村 逹男 (1990) 原田 志津子 竹内 健司 田中 幸江 湯浅 田鶴子 斎藤 泉 KUO George HOUGHTON Mike RUTTER William J.
- 出版者
- 国立予防衛生研究所
- 雑誌
- 国際学術研究
- 巻号頁・発行日
- 1988
非A非B型肝炎の起因因子はそれまでの種々の状況証拠からウイルスであることが想定されていたが、通常のウイルス分離方法や、抗原抗体検出系に基づく方法でその因子を同定することができなかった。共同研究が開始された1982年から、感染したチンパンジ-の肝組織または、血漿からRNAを抽出し、そのcDNAをライブラリ-化して、非A非B型肝炎ウイルス遺伝子の断片を得ることを試みた。1988年に、カイロンのグル-プが、λ gtllを用いたイムノスクリ-ニングによりその発現産物が非A非B型肝炎患者の血清と特異的に反応するcDNA断片を得ることに成功した(Choo et al.Science 244,359ー362;文献1)。日本で全く独立にそれまでに収集、解析されていた輸血後非A非B肝炎の患者の血清中に病型に対応してこの抗体の産生が認められた。更にこの患者に実際に輸血された血液の供血者にもこの抗体が検出された(文献2及び4)。この抗体は日本の非B型の肝がん患者の実に60〜70%にも検出される(文献3)。カイロングル-プはgene walkingによりこのcDNAが長さ約9.5キロベ-スの一本鎖RNAをそのゲノムとしてもつ全く新しいRNAウイルスであることをつきとめ、これをC型肝炎ウイルス(HCV)と名付けた(Choo et al.1989,Science 244,359ー362;Choo et al.1991,Proc.Natl.Acad.Sci.in press)。一方予研側は、このカイロンとの共同研究から塩基配列の情報を得て、日本人の供血者からHCVのcDNA断片を直接PCR法によって増幅、クロ-ン化した(文献6、7、9、12)。つまり日本とアメリカとで、各々ヒトと実験的に感染させたチンパンジ-の血液からHCVcDNAを得ることができた。この2つのHCVのcDNAの塩基配列とアミノ酸の配列を比較、更に類似していることが以前から提唱されているフラビウイルスのそれと比較した。フラビウイルスとの類似性もさることながら、ウシ下痢症ウイルスなどペスティウイルスとの一部の相同性もみつかり、これら3種のウイルスが互いに類似しながら全く別のウイルスであることが明らかとなった。この間、カイロングル-プは、HCVの非構造遺伝子NS4の領域を酵母で発現させ、その発現産物を利用した特異抗体検出ELISAを作出した。この検査法の有用性を世界で最初に示したのがこの協同研究による日本での患者及び、供血者での血液検査であった。その結果1989年の11月、日本が世界に先駆けて、このHCV抗体アッセイを輸血のスクリ-ニングに用いることとなった。このHCV抗体アッセイ系はその後世界中で輸血用血液のスクリ-ニングに用いられるようになっているが、C型肝炎の診断には必ずしも適さない点があった。我々の初期の検討により抗体が陽転するまでに数カ月を要することが示されていたからである。日本でのクロ-ン化されたHCVの遺伝子構造を詳細に調べた。まず、ウイルスの構造蛋白をコ-ドする構造遺伝子をサルCOS細胞でSRαプロモ-タ-の統御下で組換え、更にバキュロウイルスを用いて昆虫細胞でヌクレオキャプシド(コア)蛋白を発現させることに成功した(文献14、15、16)。これらの蛋白に対する抗体が患者血清中に特異的に検出されることにより同定することができた。これにより遺伝子の機能を同定されたのみならず、この蛋白を用いたELISAが、C型肝炎の早期診断やより感度の高い輸血血液のスクリ-ニングにも応用可能であることが示された。現在世界各国の協同研究者とその有用性を検討している。このコア蛋白にひきつづきエンベロ-プ蛋白の発現実験にも成功した(論文準備中、Matsuura et al)。分子量約35キロダルトンの糖蛋白である。この蛋白及びその下流にあるNS1の領域の発現産物を用いて今後、ワクチンやγーグロブリン製剤の実用化を検討してゆきたい。
1 0 0 0 C型肝炎ウイルスの遺伝子発現と肝炎・肝癌発症
日本の慢性肝炎(120万人)の半数以上、最近の肝細胞癌全体(1万8千人/年)の半数近くがC型肝炎ウイルス(HCV)によるものと考えられている。クロ-ン化したウイルスcDNAを用いてHCV遺伝子産物の発現系・検出系を開発し、肝炎・肝癌組織中で発現するHCV遺伝子産物を検討することにより、このウイルスによる肝炎・肝癌発症機構解明の基礎を確立するのが本研究の目的である。1.HCVの構造領域cDNAを組み込んだバキュロウイルス発現ベクタ-やプラズミドベクタ-をサル由来細胞株に導入することによりHCVの構造蛋白を発現させた結果、HCVのコア蛋白とエンベロ-プ蛋白の発現と同定に成功した。コア蛋白は糖鎖のつかない22kdの蛋白で、p22と命名し、エンベロ-プ蛋白は糖鎖を持つ35kdの蛋白でgp35と命名した。また粗精製したp22蛋白を用いてHCVのコア蛋白に対する抗体(コア抗体)を検出する実用的なELISAを作製した。2.組換えバキュロウイルスにより産生されたコア蛋白などを抗原として、構造蛋白の検出に用いられるモノクロ-ン抗体を作製した。3.非B型肝癌の8例において、癌部と非癌部からRNAを抽出し、PCR法によりHCVRNAを検出した結果、少なくとも一部の非B型肝癌組織からHCVRNAが検出されることが分かった。本研究によりHCV構造蛋白の特異抗体作製への道が開かれ、患者組織におけるウイルス抗原の検出への基礎が開けたといえよう。一部の肝癌組織からHCVRNAが検出されることは、持続感染状態にあるHCVが細胞の癌化に何等かの役割を果たしている可能性を示唆するが、その証明には今後の定量的検討が必要であろう。
1 0 0 0 肝炎ウイルスと肝発がん
B型肝炎ウイルス(HBV)およびC型肝炎ウイルス(HCV)はヒト肝がん発症の原因ウイルスと考えられている。HBVにおいては、発がんにもっとも関係の深いと考えられるX遺伝子のトランス活性化機能が明かにされ、セリンプロテアーゼインヒビターとの構造類似性が示され、細胞の転写因子の機能を変化させることにより発がんの初期過程に関与していると推定されている。HCVについては、RNAゲノムの遺伝子構造と発現の研究が進展してきた。そこで、構造と性質の異なるこれら肝炎ウイルスの多段階発がんにおける役割を追及し、肝発がんのメカニズムを明かにする。HBVでは、X蛋白質が肝細胞中の膜結合型セリンプロテアーゼに直接結合しその活性を阻害すること、また、セリンプロテアーゼインヒビター様のドメインとトランス活性化の機能ドメインが一致することも明らかにした。他方、X蛋白質と相互作用する転写因子の存在も明らかにしつつあり、セリンプロテアーゼなど複数の細胞蛋白質と結合することを示した。HCVでは、構造遺伝子の発現様式および発現したポリ蛋白のプロセッシングに加えて、持続感染の機構を一層明らかにした。すなわち、外被蛋白質中に存在する超可変領域(HVR)の頻繁な変化によって免疫機構から逃避した遊離のHCVが、発がん過程で関与していることを示唆した。X蛋白質についてはその機能をかなり解明したので、今後は、in vivoでの動態およびX蛋白質によって促進される遺伝子変異について調べる必要がある。他方、肝発がんでのHCVの中心的遺伝子が何であるかはまだ全く不明である。持続感染の機構がウイルス外被蛋白質の頻繁な突然変異に関係していることは、組み込みが中心であるHBVの持続感染とは非常に異なっており、2つのウイルスの肝炎および肝発がんへの関与が異なるものであることを示唆した。
まずはじめに、人工肝感染実験に用いる感染性クローンの構築のため、ヒトに輸血後肝炎を発症させ、しかもチンパンジーに対する感染価も高い、一人のC型肝炎患者血清より完全長のcDNA(NIHJ1)を作製した。このNIHJ1のバキュロウイルス発現系を用いてHCV全長の遺伝子を昆虫細胞で発現させたところ、蛍光抗体法や免疫沈降法で全てのHCV蛋白の発現が認められ、前駆体蛋白のプロセッシングも完全に行われていることが確認できた。次に人工肝感染実験に用いるのに適した細胞を調べる目的で以下の実験を行った。AdexCAT7を各種細胞に感染させイムノブロット法とポリメラーゼ活性を指標にしてT7ポリメラーゼの発現を確認した。調べたほとんどの細胞で、EMCVのIRESを持つpT7EMCLucが最も高い活性を示したが、唯一,FLC4細胞のみでHCVのIRESを持ったpT7HCVLucが最も高い活性を示した。このように、EMCVに比べ効率の低いHCVのIRESを持ったpT7HCVLucの活性がFLC4細胞のみで高い価を示したことは、FLC4細胞には、HCVのミニジーンRNAを特異的に安定化させ翻訳効率を上昇させる何らかの宿主因子が存在することが示唆された。単層培養での慢性C型肝炎患者血清を用いた感染実験の結果もFLC4のみHCVRNAの検出が持続したことからも考え会わせ、このFLC4細胞を人工肝の感染実験に用いることに決定した。そして高密度培養用のバイオリアクターを用いて6O日以上にわたり、安定的に細胞培養が可能であることが示されただけでなく、低温培養により細胞の増殖速度をコントロールすることに成功した。そこでこの人工肝にまず前述のC型肝炎患者血清を感染材料として用い、人工肝から流出する培養液をサンプリングしてHCVRNAをRT-PCRで検出したところ、感染開始後1-2日まではHCVRNAは陽性であったものの、それ以降陰性であった。残念ながら培養液からは感染の確証は得られなかった。現在、我々が作製した全長のクローンおよびUSAより供与されたチンパンジーに感染を成立させた感染性クローンを用いた感染実験を継続中である。