85 0 0 0 OA 全組織イメージングとライブイメージングによるオジギソウの速い運動メカニズムの解析
オジギソウは、さわると1秒程度の時間で葉を閉じる「おじぎ運動」を行う。このすばやい植物運動がどのようなメカニズムによって行われているのかはよく分かっていない。これを解明するために、本研究では運動部位の全ての細胞の3次元形状を網羅的に解析し、それらが運動によりどのように変化するかを明らかにした。また、おじぎ運動に関わりそうな15の候補遺伝子について、機能を失わせたオジギソウを作製することでその役割を調べた。その結果、このうちの2つの遺伝子が実際におじぎ運動に重要な役割を果たしていることが明らかになった。
2 0 0 0 ハナカマキリの擬態の遺伝的メカニズム
本年度の研究実施計画に基づき、ハナカマキリの体色を形成する色素分子の生化学的解析を行った。昨年度の研究により、ハナカマキリ体色の赤色色素としてキサントマチンを同定したが、色素の抽出条件およびHPLCによる分離条件を検討した結果、ハナカマキリの色素抽出物には通常型のキサントマチンのほかに、分子上のカルボキシル基を1つ欠失した脱炭酸型のキサントマチンが含まれることを見出した。赤と黒を基調とした体色を持ち、カメムシ幼虫に擬態しているとされるハナカマキリの1齢幼虫では、相対的に多量の脱炭酸型が含まれていた。一方、花に擬態する2齢幼虫以降のステージでは、脱炭酸型キサントマチンの含有比率が次第に低下すると判明した。1齢幼虫の赤色部位はやや黄色味がかった赤色であるのに対し、後期幼虫の赤色部位は紫がかった赤色をしており、この色調の違いはキサントマチンの通常型と脱炭酸型の含有比率の違いによって生み出されている可能性が考えられた。また、ハナカマキリ後期幼虫の脚部にある花弁様構造の反射スペクトルを測定した結果、534nm付近に吸収ピークをもつスペクトル形状を示した。これは中性バッファー中における酸化型および還元型キサントマチンの吸収スペクトル(吸収極大波長はそれぞれ440nmと495nm)とは大きく異なる一方、還元型キサントマチンの凝集体の懸濁液の吸収スペクトルとは良く似た形状を示した。以上の結果から、ハナカマキリの花擬態に特有の赤紫色は、還元型キサントマチンが組織内に凝集体として存在することによって形成されていると推測された。
- 著者
- 前田 太郎
- 出版者
- 基礎生物学研究所
- 雑誌
- 新学術領域研究(研究領域提案型)
- 巻号頁・発行日
- 2013-04-01
本研究の目的は、ウミウシの盗葉緑体現象を通して、遺伝子の水平伝播と複合適応形質の進化の関連を議論することです。盗葉緑体現象とは、嚢舌目ウミウシなどが、餌海藻の葉緑体を細胞内に取り込み、数ヶ月間光合成能を保持し、栄養を得る現象の事です。これには、藻類核からウミウシ核への遺伝子水平伝播が伴うと考えられており、遺伝子の水平伝播によって、光合成という複合適応形質が、生物界を超えて、水平伝播することを示唆しています。しかしウミウシのゲノムは解読されておらず、遺伝子が本当に伝播しているかは不明確でした。本研究では、複数種のウミウシのゲノム解読を行い、遺伝子の水平伝播の有無と過程を明らかにしようとしました。更にパルス変調蛍光定量法を用いて、水平伝播した各遺伝子が実際に光合成能の各段階に関与しているかを明らかにしようとしました。本研究により、盗葉緑体能力が発達した、チドリミドリガイ(Plakobranchus ocellatus)とコノハミドリガイ(Elysia ornata)のゲノム解読に成功しました。また餌藻類であるHalimeda borneensisとBryopsis hypnoidesのトランスクリプトーム解析により藻類の遺伝子情報を獲得しました。これらの比較を行った結果、先行研究と異なり、これらのウミウシ核には、藻類に由来する遺伝子は水平伝播しておらず、本現象が遺伝子の伝播を伴わずに形質が伝播する特殊な進化的現象であることを示唆しました。一方、パルス変調蛍光法などにより、ウミウシ内の葉緑体では、光合成活性が光損傷などで失われても、葉緑体での新規タンパク質合成により活性を回復できることがわかりました。また盗葉緑体を行うウミウシ類だけで特異的に重複し、更に葉緑体蓄積組織で特異的に発現する遺伝子群を発見しました。
2 0 0 0 作業環境測定における空中の自然放射性物質の影響
法令に基づき、月に一度、空気中の放射性物質の濃度測定を行っているが、放射性物質の使用がなかった実験室で、バックグランドより高い数値が検出されることがあった。検出された数値は、自然放射性物質であると考えられる。そこで、作業環境測定に及ぼす影響を知るため、自然放射性物質の測定を行った。(1)自然放射性物質の定期測定1年間、週1回定期測定を行った。試料採取はダストサンプラを使用し、ろ紙に吸着させた。採取場所は、非管理区域の屋内で行い、採取時間は8時間、採取量は約10,000L採取した。試料測定は、液体シンチレーションカウンタを使用し、採取直後から1時間測定を60回行った。また、バックグランドとして未使用のろ紙の測定値を使用した。作業環境測定への影響を知るために、同じ条件である屋内で採取したためか、採取日による測定値の変動は見られたが、季節・湿度・温度との相関は見られなかった。また、天気との関連については、採取日に雨の日が少なかったため、雨の日との関連は分からなかった。晴れの日と曇の日では、曇の日が高い傾向があったが統計的に言えるほどではなかった。また、当センターの定期作業環境測定では自然放射性物質の影響を除去するため、採取の48時間経過後に測定を行っている。経時変化を見るとほとんどの採取試料が48時間後には、バックグランドまで下がるが、採取直後の測定値が高いときなどに、48時間経過してもバックグランドまで下がらないことがあった。(2)採取した自然放射性物質の核種同定試料採取は(1)と同様に行い、名古屋大学アイソトープ総合センターにて、ゲルマニウムγ線スペクトルメータで核種を同定した結果、天候によるエネルギーのピークの位置の差はなく、4回ともトリウム壊変系列やウラン壊変系列由来の自然放射性物質であった。これらのことから、当センターでの作業環境測定に影響をあたえる自然放射性物質の基礎的な情報を得ることができたと考える。
2 0 0 0 OA オジギソウはなぜ動くのか:適応進化的意義の探求
オジギソウの運動の適応的意味を解明するため、運動に異常の生じた 突然変異体の作出を試み、約5000 変異体の選抜を行ったが単離には成功しなかった。一方、逆 遺伝学的方法によって運動に異常を起こす突然変異体を得るため、オジギソウ形質転換体の作 出を試み成功した。今後、本研究によって確立した形質転換技術を用いてオジギソウの運動の 分子機構を明らかにするとともに運動に関わる遺伝子を逆遺伝学的方法で機能喪失させること により運動欠損変異体を作出し、運動の適応的意義についての研究を行うことが可能となった。
1 0 0 0 OA 共生の宿主植物が微生物パートナーの不正を防ぐ仕組みの解析
1 0 0 0 OA 植物の活動電位発生伝搬機構の分子基盤解明と進化過程推定
1 0 0 0 ナトリウム恒常性維持中枢の神経回路構造と機能の解明
Naxナトリウムチャンネルの個体における生理機能を解析し、体液ナトリウム濃度検出中枢を特定する目的で、野生型マウスとNax遺伝子ノックアウトマウスについて塩分摂取行動を調べた。通常状態と脱水状態それぞれのマウスに水と食塩水を同時に提示し、各摂取量を調べた。複数の濃度の食塩水について検討したところ、通常状態においてはいずれのマウスも0.3Mを超えると、水に対する食塩水摂取量の割合が減少した。脱水状態においては、野生型マウスは、より低濃度の食塩水に対しても回避行動を示したが、ノックアウトマウスは絶水前と同様に0.3M付近まで水と食塩水を区別無く摂取した。次にマウスの脳室へ高張食塩水を注入し、脳室周辺部の体液Na濃度を上昇させると、野生型マウスは脱水時と同様の塩分回避行動を示した。一方、ノックアウトマウスでは脱水時の塩分回避行動が失われており、Naxによる体液Naレベル検出は、脳室周囲器官の内のいずれかの部域において行われていることが明らかとなった。そこで、Nax遺伝子を組み込んだアデノウィルス発現ベクターを作成し、ノックアウトマウスの脳室周辺へ導入し、塩分摂取行動を観察した。その結果、CVOsの内、脳弓下器官(SFO)にウィルスが感染した場合にのみ野生型と同様の、脱水時における塩分回避行動が回復した。SFOは過去の脳部分破壊実験から体液Na濃度検出への関与が指摘されており、Naxが発現する部位である。同じく第三脳室前壁に位置する終板脈管器官(OVLT)も、これまで体液Na濃度検出に関与すると考えられていたが、本実験においてNax遺伝子を導入しても行動は回復しなかった。以上より、体液Na濃度検出及び水と塩分の摂取行動制御中枢はSFOであり、その機能にNaxが必須の役割を果たしていることが初めて証明された。
1 0 0 0 体温調節に関わるGABA作動性神経活動の光操作制御
- 著者
- 山中 めぐみ
- 出版者
- 基礎生物学研究所
- 雑誌
- 研究活動スタート支援
- 巻号頁・発行日
- 2009
体温調節中枢は視床下部の視索前野(POA)に存在し、生体内外の環境変化を末梢からの入力として受けている。それにより、POAからの出力が変化し、その環境変化に応じた体温調節反応が引き起こされる。POA内には、GABA作動性神経があり、体温調節制御に重要な役割を担っている。そこで本研究は、遺伝子改変技術を用い、マウスに光活性化タンパク質であるチャネルロドプシン2(ChR2)およびハロロドプシン(Halo)をGABA作動性神経特異的に発現させ、そして、その神経活動を光によって制御することにより、無麻酔・無拘束下において、GABA作動性神経による生理的な体温調節反応機構についての解析を行うことを目的とする。ChR2およびHaloはそれぞれ非選択的陽イオンチャネルおよびクロライドポンプを形成し、ChR2は青色光により活性化されて、イオンチャネルを開口、膜電位を脱分極させることで、神経細胞では閾値を超えると活動電位を発生させることが出来る。一方、Haloは黄色光で瞬時に反応し、細胞外から細胞内ヘクロライドイオンを流入させ、膜電位を過分極させることによって、活動電位発生を抑制する。今年度は、本マウスを作成し、抗Gad67抗体を用いた免疫染色によって、光活性化タンパク質がGABA作動性神経特異的に発現していることを確認した。さらに、このマウスから脳スライス標本を作製し、GABA作動性神経にパッチクランプを行った。HaloはGFPとの融合タンパク質として発現しているため、GFPの蛍光を指標としてGABA作動性神経を同定した。電流固定により膜電位を記録しながら、対物レンズから黄色光(580nm)を記録神経細胞に照射すると、瞬時に強い過分極が生じ活動電位発生を完全に抑制することに成功した。このことより、in vitroにおいて光活性化タンパク質が正しく機能していることが確認できた。
1 0 0 0 メダカを用いた、配偶者選択行動の神経系動作原理の解明と展開
採用1年目、2年目でメダカの配偶者選択行動の結果、メダカメスは見知ったオスを好んで配偶相手として受け入れることを見出し、その意思決定段階に終神経GnRH3ニューロンが関わることを明らかにしたが、この「個体の記憶に基づく意志決定のシステム」の進化的保存性については未知な部分が多い。そこで、一般化するためMIT利根川研究室においてマウスを用いた個体記憶に関する行動定量システムを独自に考案した。このシステムとオプトジェネティクスの手法を組み合わせて海馬での個体記憶を担う領域を同定した。まず初めに、マウスの個体記憶をアッセイする行動実験系として、社会性識別テスト(social discrimination test)と 侵入者テスト(resident-intruder test)の行動実験系 を立ち上げた。社会性識別テストは、マウスが新規な個体に強く接近することをアッセイするテストであり、 テストチャンバーのなかに新規個体と既知個体を入れたペンシルホルダーを設置すると、マウスは新規個体の周囲を好み、積極的に匂いを嗅ぐ。テストマウスの動きをチャンバーの上から録画した後、行動解析ソフトでマウスの鼻の位置をトラッキングし、鼻が sniffing areaの中にいた時間を自動で検出したところ、確かに有意に新規個体へと接近することを確認した。さらに、緑光刺激依存的に神経興奮を阻害する eArchT3.0タンパクを用いて、個体記憶を担う脳領域の探索を行った。AAVrh8-CamK2:eArchT-EYFP を顕微注入したマウスを用いて、 社会性識別テストと侵入者テストを行った結果、海馬の小領域の神経興奮を阻害したマウスは社会性識別テストと侵入者テストに異常を示した。
1 0 0 0 OA ピンクのカマキリはどうやって生まれたか:花に擬態するランカマキリの体色進化の解明
ランカマキリは花に類似した姿をした擬態昆虫である。これまでに我々は、ランカマキリの体色を生成する色素分子としてキサントマチンを同定した。しかし、キサントマチン自体は昆虫において広く存在する色素であり、これがどのようにして特有のピンク色を形成しているのかは不明であった。本研究の生化学的解析により、キサントマチンには実は3種類の類縁分子が存在し、その組成の違いによって異なる体色が生成されると示唆された。また、電子顕微鏡を用いた観察により、ランカマキリ体内においてはキサントマチン分子が特殊な細胞内構造を取っていることが明らかになった。これらのメカニズムによって特有の体色が生成されると考えられた。
1 0 0 0 OA 分光・ラマンイメージングが可能なライトシート型顕微鏡λ-DSLMの開発
1 0 0 0 OA 複合適応形質進化の遺伝子基盤解明
- 著者
- 長谷部 光泰 倉谷 滋 嶋田 透 藤原 晴彦 川口 正代司 深津 武馬 西山 智明 岡田 典弘 阿形 清和 河田 雅圭 郷 通子 豊田 敦 藤山 秋佐夫 望月 敦史 矢原 徹一
- 出版者
- 基礎生物学研究所
- 雑誌
- 新学術領域研究(研究領域提案型)
- 巻号頁・発行日
- 2010-04-01
本領域の目的である、多様な研究から「複合適応形質進化の共通メカニズム」を推定するという総合的研究を展開する、進化生物学とゲノム生物学を融合させる、を実現するため総括班を有機的に組織し、下記の活動を行い、効率的に連携できた。(1)領域会議を年2回、インフォマティクス情報交換会を5年で18回、ニュースレターを5年で63号発行し、領域内での情報共有、共通意識形成を行った。(2)ゲノム支援活動として実験方法のアドバイス、ゲノム配列決定支援、外部委託についてのアドバイス、各班のインフォマティクス担当者などに指導を行った。(3)形質転換実験技術支援を行った。(4)国内、国際シンポジウムをほぼ毎年開催した。
1 0 0 0 OA 生殖腺の性差構築と維持機構の解明
- 著者
- 田中 実 小林 悟
- 出版者
- 基礎生物学研究所
- 雑誌
- 新学術領域研究(研究領域提案型)
- 巻号頁・発行日
- 2010-04-01
身体が作られる過程において、雌雄の決定(性決定)はまず体細胞で行われる。この影響を受けて生殖細胞は卵になるか精子になる(生殖細胞の性決定)が、生殖細胞内でどのようなメカニズムによって性が決まるかは不明であった。本研究の結果、遺伝的制御の基盤が明らかとなり、身体の性決定前から生殖細胞にはY染色体依存的な性差があることが明らかとなった。さらに最終的に卵か精子になるスイッチ遺伝子の同定に成功し、スイッチを切り替えると、卵巣内で機能的な精子が作られる。また適切な性分化のためには、内分泌制御によってゲノムワイドにエピゲノム状態が影響されることが必要で、その制御が乱れると性転換が生じるとの知見が得られた。
1 0 0 0 複製フォーク阻害によって誘導される組み換え反応と遺伝子増幅
堀内らは、この研究領域の開始前までに、(1)大腸菌の複製フォーク阻害部位(Ter)において相同組換えの活性化が起こり、ホットスポット(Hot)となること、(2)出芽酵母のリボソームRNA遺伝子(rDNA)リピート内にある複製フォーク阻害部位(RFB)における阻害が、rDNA領域内の組換え、さらにコピーの増減に必須であることを見出していた。その後本研究により(1)大腸菌のTer近傍に見出した組換えのHotにおいても、遺伝子増幅が起こり、酵母とは異なりローリングサークル型複製により、菌集団の約10%の細胞でHot領域が約400倍に増幅することを見出した。(2)一方、以前から酵母のサイレンシングタンパクの一つSir2がrDNAリピート内発現の抑制(サイレンシング)と組換えの抑制に必須なことは知られていたが、機構は不明であった。我々はsir2欠損下では35SrDNA間に存在する両方向のRNAポリメラーゼIIプロモーターの発現の抑制(サイレンス)が解除され、転写が起こる結果、その領域に結合していたコヘーシンが外れ、その領域の姉妹染色体間の結合がゆるむ結果、非対称的組換えが活性化(コピー数変動)されることを見出した。(3)fob1欠損下ではrDNAのコピー数は凍結するが、高いコピー数は維持される。この未知の維持機構を明らかにしようと、fob1欠損下でコピー数維持不能変異株を多数分離し解析したところ、6株のコンデンシンの変異株を分離した。コンデンシンタンパクの局在化の解析から、コンデンシンはS期にrDNAのRFBにFob1依存的に特異的に結合することを見出し、rDNAのコピー数の維持に必須であることを明らかにした。一方篠原らは、減数分裂期に起こる相同組換えの分子機構を解析し、特にこの時期に働くことが知られているRecAホモログDmc1と共同して働く因子を探索することで、二つの新しい因子Mei5とSae3を見出し、3者の染色体への結合が相互依存的であることから、3者は複合体として働くと結論した。