著者
河岡 義裕 喜田 宏 堀本 泰介
出版者
東京大学
雑誌
基盤研究(A)
巻号頁・発行日
2000

全世界で2000万人以上のヒトを殺したスペイン風邪のように、新型インフルエンザウイルスの出現派は世界的な大流行を引き起こし、未曾有の大惨事を引き起こす。1997年に香港に出現したH5N1新型インフルエンザウイルスは、18名のヒトに直接伝播し、6名の命を奪った。幸いにもヒトからヒトへと伝播することはなかったが、病原性の強さはスペイン風邪に匹敵するほどであった。近年我々が開発したリバース・ジェネティクス法を用いることで、ウイルス蛋白質に任意の変異を導入し、哺乳類での病原性獲得メカニズムを明らかにすることが可能になった。本研究は、香港で分離されたH5N1ウイルスをモデルとして、トリインフルエンザウイルスがどのようにヒトに病原性を示すようになるのかを分子生物学的に解明することを目的とした。哺乳類に強い病原性を示すウイルス株と弱い病原性を示すウイルス株とのアミノ酸配列を比較すると、それらの間には数箇所しか違いがないことがわかった。各アミノ酸に点変異を導入しウイルスを人工合成することで、どのアミノ酸が哺乳類における病原性発揮に関与しているかを調べた。その結果、RNAポリメラーゼ蛋白質を構成するPB2蛋白質の627番目のアミノ酸の変異(グルタミン酸がリジン)が、トリインフルエンザウイルスが哺乳類で病原性を発揮するために必要であることが明らかになった。
著者
喜田 宏 河岡 義裕 岡崎 克則 伊藤 寿啓 小野 悦郎 清水 悠紀臣
出版者
北海道大学
雑誌
国際学術研究
巻号頁・発行日
1991

我々は鳥類,動物および人のインフルエンザウイルスの生態を研究し,得られた成績に基づいて,1968年に人の間に出現した新型インフルエンザウイルスA/HongKong/68(H3N2)株のヘマグルチニン(HA)遺伝子の導入経路を推定し,提案した。すなわち,渡り鴨の間で継持されているH3インフルエンザウイルスが中国南部で家鴨に伝播し,さらにこれが豚に感染した。豚の呼吸器にはそれまでの人の流行株でうるアジア型(H2N2)ウイルスも同時に感染し,両ウイルスの間で遺伝子再集合が起こって,A/HongKong/68株が誕生したものと結論した。今後もこのような機序による新型ウイルスの出現が予想されるので,渡り鴨と豚のインフルエンザの疫学調査と感染実験を継続することによって,新型ウイルスを予測する研究を計画した。インフルエンザウイルスの供給源として,北方から飛来する渡り水禽および中国南部の家禽集団が考えられて来た。毎年,秋に飛来する渡り鴨からウイルスが高率に分離され,春に北方に帰る鴨からはほとんど運離されないことから,北方圏の鴨の営巣地が一次のウイルス遺伝子の貯蔵庫であると推定した。そこで,本学術調査では1991年および1992年の夏に,米国アラスカ州内の異なる地域で水禽の糞便を収集し,これからウイルスの分離を試みた。マガモとオナガガモ計1913,カナダガン1646,白鳥6,シギクおよびカモメ7合計2579の糞便材料から75株のインフルエンザウイルスおよび82株のパラミクンウイルスを分離した。インフルエンザウイルスはほとんどがアラスカ中央部ユコン平原の湖に営巣する鴨の糞便材料から分離されたが,南部のアンカレジ周辺や北部の材料からの分離率は極めて低かった。分離されたインフルエンザウイルスの抗原亜型はH3N8が14,H4N6が47,H8N2が1,H10N2が1,H10N7が11およびH10N9が1株であった。抗原亜型およびウイルスの分離率は,糞便材料を収集した鴨の営巣地点によって異なっていた。1992年には湖沼水からのウイルス分離をも試み,鴨の糞便から得られたものと同じH4N6ウイルスがそれぞれ2つの異なる湖の水から分離された。鴨の営巣地でその糞便から分離された14株のH3インフルエンザウイルスのHAの抗原性をモノクローナル抗体パネルを用いて詳細に解析した結果,A/HongKong/68ならびにアジアで鴨,家鴨および豚から分離されたH3ウイルスのHAと極く近縁であることが判明した。この成績は水禽の間で継持されているインフルエンザウイルスの抗原性が長年にわたって保存されているとの先の我々の見解を支持する。以上のように,鴨が夏にアラスカの営巣地でインフルエンザウイルスを高率に保有しており,湖水中にも活性ウイルスが存在することが明らかとなった。従って,北方の鴨の営巣地が一次のインフルエンザウイルス遺伝子の貯蔵庫であるとの推定が支持された。秋に鴨が渡りに飛び発つ前に,糞便と共に湖沼中に排泄されたウイルスは冬期間,凍結した湖水中に保存され,春に帰巣する鴨がこれを経口摂取して感染し増殖することを繰り返して存続して来たのであろう。秋,冬および春に一定の鴨の営巣地点で水,氷および凍土を検索することによって,自然界におけるウイルスの存続のメカニズムならびに遺伝子進化を知ることができるであろう。水禽の糞便から分離されたパラミクンウイルス82株のうち81株はニユーカッスル病ウイルス(NDV)であった。これらNDVのHNおよびF糖蛋白の抗原性をモノクローナル抗体パネルを用いて詳細に解析した結果,ワクチン株と異なるものが優勢であった。水禽の間に高率に分布しているNDVが家禽に導入される可能性が考えられるので,渡り鴨の糞便から分離されるNDVの抗原性ならびに鴨に対する病原性を継続して調査する必要があろう。
著者
喜田 宏 伊藤 壽啓 高田 礼人 岡崎 克則 河岡 義裕
出版者
北海道大学
雑誌
基盤研究(A)
巻号頁・発行日
1998

シベリアの水禽営巣地ならびに北海道で採取した野鳥の糞便からインフルエンザウイルスを分離し、シベリアに営巣する水禽が様々なHA亜型のインフルエンザウイルスを保持していることを明らかにした。NPならびにH5HA遺伝子の系統進化解析の結果、1997年に香港のヒトとニワトリから分離された強毒H5N1インフルエンザウイルスの起源がこれらの水禽類にあることが判った。したがって、今後ヒトの間に侵入する新型ウイルスのHA亜型を予測するため、シベリア、アジアを含む広範な地域で鳥類インフルエンザの疫学調査を実施する必要がある。北海道のカモから分離した弱毒H5N4ウイルスを用いて強毒H5N1ウイルス感染に対するワクチンを試製し、これが有効であることを示した。そこで、疫学調査で分離されるウイルスは新型ウイルス出現に備え、ワクチン株として系統保存する計画を提案した(日米医学協力研究会2000、厚生省1999)。中国南部のブタにおける抗体調査の結果から、H5ウイルスの感染は少なくとも1977年から散発的に起こっていたことが判明した。一方、H9ウイルスは1983年以降に中国南部のブタに侵入し、その後ブタの間で流行を繰り返していることが判った。
著者
喜田 宏 伊藤 壽啓 梅村 孝司 藤田 正一 前出 吉光 中里 幸和 高田 礼人 岡崎 克則 板倉 智敏
出版者
北海道大学
雑誌
基盤研究(A)
巻号頁・発行日
1996

ウイルスの病原性発現機構を宿主側の要因を詳細に解析することによって究明することを目的とした。そのため、ウイルス感染によって誘発される宿主細胞由来病原性因子の検出を試みた。インフルエンザウイルス感染発育鶏胚の奨尿膜を超音波破砕し、その可溶性画分をニワトリの静脈内に注射した。ニワトリは汎発性血管内凝固により数分以内に斃死した。この致死活性はヘパリンを静脈内に前投与することによって抑制されたことから、本因子は血液凝固に関与する物質と推定された。陰イオン交換体を用いた高速液体クロマトグラフィーおよび塩析法によって病原性細胞因子を濃縮精製する系を確立し、粗精製致死因子をマウスに免疫して、モノクローナル抗体11クローンを作出した。ニワトリの鼻腔内にインフルエンザウイルス強毒株と弱毒株を実験感染させ、経過を追及した。強毒株はウイルス血症を起こしたが、弱毒株はウイルス血症を起こさなかった。すなわち、強毒株を接種したニワトリでは全身臓器の血管内皮細胞でウイルス増殖が起こり、血管炎を招来した。強毒株の標的が血管内皮細胞であることが明らかになった。損傷した血管内皮細胞から血液凝固因子ならびにサイトカインが放出された結果、汎発性血管内血液凝固を起こし、ニワトリを死に至らしめるものと結論した。この成績はインフルエンザウイルス感染鶏胚奨尿膜から抽出した細胞因子がニワトリに血管内凝固を起す事実と一致する。汎発性血管内血液凝固症候群は様々なウイルス感染症で認められる。したがって、この細胞因子はインフルエンザのみならず他のウイルス感染症においても病原性発現に重要な役割を果たすものと考えられる。ウイルス感染症の治療法を確立するため、本致死因子をコードする遺伝子を同定する必要がある。
著者
梅村 孝司 朴 天鎬 喜田 宏
出版者
北海道大学
雑誌
基盤研究(B)
巻号頁・発行日
2007

鞘内免疫(脳脊髄液に抗原を接種し、脳脊髄液に特異抗体を誘導する免疫法)によって脳脊髄液に誘導された特異抗体は脳で産生されていること、鞘内免疫は狂犬病およびオーエスキー病に対し完全なワクチン効果を発揮すること、鞘内免疫は狂犬病の治療にも応用可能であることを示した。また、インフルエンザ脳症の原因はIFV感染が引き金となって起こった高サイトカイン血症/IFV感染と菌体内毒素血症の重複である可能性を示した。
著者
野牛 一弘 梁川 良 松浦 善治 福士 秀人 喜田 宏 野田 寛
出版者
社団法人日本獣医学会
雑誌
日本獸醫學雜誌 (ISSN:00215295)
巻号頁・発行日
vol.44, no.4, pp.691-693, 1982-08-25

北海道で1978-1980年に1278頭のミンクについて各種A型インフルエンザウイルスに対する抗体調査を行なった. 1980年の11月および12月に, それぞれ175例中35例(18%)および110例中44例 (40%) に A/Hokkaido/45/80 (H3N2) に対する抗体が検出され, 抗体陽性ミンク中48例 (64%) が 1:512 以上のHI抗体価を示した. 野外のミンクにおいてインフルエンザの流行が血清学的に明らかにされたのは今回が初めてと考えられる.
著者
伊藤 美加 長井 誠 早川 裕二 小前 博文 村上 成人 四ッ谷 正一 浅倉 真吾 迫田 義博 喜田 宏
出版者
社団法人日本獣医学会
雑誌
The journal of veterinary medical science (ISSN:09167250)
巻号頁・発行日
vol.70, no.9, pp.899-906, 2008-09-25
参考文献数
39

2007年8月,石川県金沢競馬場において馬インフルエンザが発生した.感染馬の症状は主に発熱(38.2-41.0℃)および鼻汁漏出で,呼吸器症状を示した馬はわずかであった.全ての競走馬は不活化ワクチンを接種しており,ワクチンにはH3N8馬インフルエンザウイルス,アメリカ系統のA/equine/La Plata/93株,同じくヨーロッパ系統のA/equine/Avesta/93株,およびH7N7馬インフルエンザのA/equine/Newmarket/1/77株が含まれていた.鼻腔スワブ材料からH3N8馬インフルエンザが分離され,A/equine/Kanazawa/1/2007と命名した.系統樹解析では,A/equine/Kanazawa/1/2007株はアメリカ系統のフロリダ亜系統に属した.さらに,HA1サブユニットのアミノ酸解析を行ったところ,同じアメリカ系統のワクチン株であるA/equine/La Plata/93株と比較して,BおよびEの抗原決定部位に4アミノ酸の置換が認められた.また,回復期の馬16頭から採材した血清を用いて赤血球凝集抑制反応を実施したところ,A/equine/Kanazawa/1/2007株とワクチン株間に1〜3管の差が認められた.これらの結果から,流行株とワクチン株に抗原性状の差が示唆されたが,わが国の現行市販ワクチンは罹患率の低下や発症期間の短縮に貢献したと思われた.
著者
喜田 宏
出版者
北海道大学
巻号頁・発行日
1977

博士論文
著者
伊藤 壽啓 喜田 宏
出版者
北海道大学
雑誌
一般研究(C)
巻号頁・発行日
1994

インフルエンザウイルスは人の他に多くの鳥類および哺乳動物に感染する。ニワトリ、ウマ、ブタ、ミンク、アザラシ等に致死的な流行を起こし、その被害は甚大である。最近、これらのインフルエンザウイルスの遺伝子はすべて野生水禽のウイルスに由来することが明らかとなった。また、渡りガモのウイルスが中国南部でアヒルを介してブタに伝播し、ブタの呼吸器でヒトのウイルスと遺伝子再集合体を形成することによってヒトに導入されたという新型ウイルスの出現機構が明らかにされた。しかし、ウイルスが異なる動物種間を伝播するメカニズムが解明されていない。我々はインフルエンザウイルスの宿主域とレセプター特異性が関連する成績を得た。本研究はレセプター特異性を分子レベルで解析することにより、インフルエンザウイルスの異動物種間伝播のメカニズムを明らかにすることを目的として企画された。まずインフルエンザウイルスの代表的な宿主であるカモ、ウマおよびブタの標的細胞表面のレセプターの糖鎖構造をシアル酸の結合様式の違いを認識するレクチンを用いて解析した。これにより、ウイルスのレセプター結合特異性と宿主細胞表面の糖鎖構造が宿主域を決定する重要な要因であることを証明した。一方、シアル酸の分子種の違い(Neu5Ac,Neu5Gc等)を認識する特異抗体を用いて、N-グリコリル型シアル酸(Neu5Gc)の分布がカモのウイルスの腸管での増殖部位と相関する成績を得た。さらに、このNeu5Gcを認識するヒト由来ウイルス変異株のヘマグルチニンを持ち、他の遺伝子は全てカモのウイルス由来である遺伝子再集合体を得た。このウイルスがカモの腸管で増殖するか否かを現在検討中である。これによりインフルエンザウイルスのカモの腸管における増殖に関わる因子が明らかになるであろう。また、この研究過程で各種動物由来赤血球を用いた凝集試験により、インフルエンザウイルスのレセプター特異性を調べる簡便法を確立した。古くから知られるこのインフルエンザウイルスの血球凝集の機構をウイルスのレセプター結合特異性と血球表面に存在する糖鎖構造という観点から究明することが出来た。今後はヘマグルチニン以外のウイルス構成蛋白に関してインフルエンザウイルスの宿主域に関わる因子を明らかにし、インフルエンザウイルスの異動物種間伝播のメカニズムをさらに解明したい。
著者
喜田 宏 河岡 義裕 WEBSTER R.G. 岡崎 克則 伊藤 寿啓 R.G.WEBSTER
出版者
北海道大学
雑誌
国際学術研究
巻号頁・発行日
1993

平成3-4年度の文部省科学研究費・国際学術研究(0304103)および平成5年度の本研究による調査の結果、アメリカ合衆国アラスカ州中央部の湖沼に営巣する渡り鴨が、夏季にインフルエンザウイルスを高率に保有していることが判明した。平成6年度には前年度にひき続き、アラスカ州中央部のユコン平原にあるマラ-ド湖、ハート湖およびビッグミント湖で鴨の糞便材料を採取し、ウイルス分離試験を実施すると共に、湖水からのウイルス分離を試みた。さらに、分離ウイルスの抗原亜型を決定した上で、これまでに得られたウイルス株を加えて、分離年、分離地および亜型が異なるウイルスのNPおよびHA遺伝子の塩基配列を決定し、系統進化解析を行った。平成5年度および6年度に鴨の糞便541検体から分離されたインフルエンザウイルスは33株、パラミクンウイルスは15株であった。イルフルエンザウイルスの抗原亜型は、H3N8が23株、H4N6が8株、そしてH7N3が1株であった。文部省科学研究費により実施した平成3年および4年度の調査成績をあわせると、4年間に分離されたインフルエンザウイルスは108株で、その内訳は、H2N3が1株、H3N8が37株、H4N6が55株,H10N9が1株であった。従って、アラスカ中央部に夏季に営巣する鴨が多くの異なる抗原亜型のウイルスを維持していることならびに同じ営巣湖沼に異なる抗原亜型のインフルエンザウイルスが共循環していることが明らかとなった。また、鴨が夏季に巣を営み、ヒナを育てる湖沼の水からもインフルエンザウイルスが分離された。平成6年8月8日に採取したビッグミント湖の水13サンプルのうち7検体からインフルエンザウイルスが分離され、湖水1ml中のウイルス感染価は10^<1.8>-10^<2.8>EID_<50>におよんだ。そこで、ほとんどすべての鴨が渡りに飛び発った後、同年9月18日に再びビッグミント湖の水を採集して、ウイルス分離を試みた。その結果、H3N8およびH7N3ウイルスが得られた。その成績は、インフルエンザAウイルスが水鳥集団の間で受け継がれており、自然界におれるインフルエンザウイルスの存続には、冬期間の湖水中の凍結保存が関与するとの我々の推定を強く支持するものである。すなわち、北方の鴨の営巣湖沼がインフルエンザウイルスの貯蔵庫であり、秋(8月中旬)に鴨が渡りに飛び発つ前にその糞便と共に排泄したウイルスが冬期間凍結した湖沼水中に保存され、春に帰巣する鴨がこれを経口摂取して感染し、増殖することを毎年繰り返して存続してきたものと考えられる。これまでにアラスカで鴨の糞便が分離されたインフルエンザウイルス108株のうち、異なる年に異なる地点で分離されたウイルス18株のNP遺伝子および6株のH3ウイルスのHA遺伝子の塩基配列を決定し、系統進化解析を行った。成績から、アラスカ中央部に営巣する鴨の糞便から分離されたウイルスのNP遺伝子およびHA遺伝子は何れも北米大陸で分離されたウイルスと同じ系統に属し、アジアおよびヨーロッパで分離されたウイルスとは異なることが判明した。これらの成績は、少なくともユコン平原に営巣する鴨はアリューシャン列島を通ってアジアに飛来することは稀であることを示している。一方、このようにウイルス遺伝子を解析することによって、その宿主島の飛翔路を推定することが可能であることが判明した。先に研究代表者らは新型インフルエンザウイルスの起源が渡り鴨のウイルスにあって、アジア、特に中国南部で家鴨および豚がその出現に関与することを証明した。従って新型インフルエンザウイルスの予測のためには、南中国に飛来する渡り鴨およびその営巣湖沼を調査することが必須である。今後シベリアの鴨の営巣湖沼におけるインフルエンザウイルスの分布を調査する計画である。
著者
伊藤 壽啓 喜田 宏 伊藤 啓史 大槻 公一 堀本 泰介 河岡 義裕
出版者
鳥取大学
雑誌
基盤研究(A)
巻号頁・発行日
1999

1997-1998年にかけて香港において鶏由来高度病原性インフルエンザウイルスがヒトに伝播し、18名の市民が感染し、うち6名を死に至らしめた。このウイルスはいずれの株も鶏に対しては一様に全身感染を引き起こし、高い致死性を示したが、哺乳動物に対する病原性では明らかに2つのグループに区別された。すなわちグループ1は50%マウス致死量(MLD_<50>)が0.3から11PFUの間であり、もう一つのグループ2はMLD_<50>が10^3以上であった。この成績から鶏由来高度病原性インフルエンザウイルスの哺乳動物に対する病原性にはウイルス蛋白の一つであるヘマグルチニンの開裂性に加えて、さらに別の因子が関与しているものと推察された。一方、野生水禽由来の弱毒インフルエンザウイルスを鶏で継代することにより、弱毒株が強毒の家禽ペストウイルスに変異することが明らかとなった。この成績は自然界の水鳥が保有している弱毒のインフルエンザウイルスが鶏に伝播し、そこで受け継がれる間に病原性を獲得し得る潜在能力を保持していること、また鶏体内にはそのような強毒変異株を選択する環境要因が存在することを示している。また、この過程で得られた一連の病原性変異株はインフルエンザウイルスの宿主適応や病原性獲得機序のさらなる解明のための有用なツールとして今後の研究に利用できる。そしてそれはプラスミドから変異インフルエンザウイルスを作出可能なリバースジェネティクス法の併用によって、さらに確実な研究成果が期待されるであろう。現在はその実験系を用いた人工ウイルスの作出に成功しており、今後、最終段階である感染実験による病原性獲得因子の解析を計画している。
著者
見上 彪 喜田 宏 生田 和良 小沼 操 速水 正憲 長谷川 篤彦
出版者
東京大学
雑誌
総合研究(A)
巻号頁・発行日
1992

本研究目的は、各種動物由来レンチウイルスを分子生物学的観点から総合的に比較研究することにより、レンチウイルスに共通に見られる遺伝特性を明らかにするとともに、その生体内での病原性の発現メカニズムを分子レベルで探ることにある。代表としてネコ免疫不全ウイルス(FIV)についての研究成果を報告する。1.日本,オーストラリアおよび米国で分離されたFIVのLTRの塩基配列を比較したところ,日本の各分離株は遺伝子レベルで米国やオーストラリア各分離株から離れた位置にあり、系統学的に異なるものと考えられた。2.組換えキメラウイルスを用いてFIV株間の生物学的性状の相違を解析したところ、LTRのプロモーター活性には有意な差は認められなかったものの,CRFK細胞への感染性やMYA-1細胞での巨細胞形成能はenvおよびrev領域が決定し,ウイルス増殖の速さや細胞障害性の強さはgag,pol,vif,ORF-Aの領域が関与しているものと考えられた。3.FIVのORF-A遺伝子に変異を導入した変異株を用いてその機能を解析したところ、ORF-1遺伝子はウイルスの効率的な増殖を促進していると考えられた。4.CRFK細胞にネコCD4を発現させた後、CRFK細胞にたいして非親和性のFIV TM1株を接種してもウイルスは増殖せず、さらに可溶化CD4とFlVenvは結合しないことから、ネコCD4は、FIVのレセプターとして機能していない可能性が示唆された。
著者
伊藤 寿啓 喜田 宏
出版者
鳥取大学
雑誌
基盤研究(C)
巻号頁・発行日
1996

インフルエンザウイルス(IFV)は哺乳動物や鳥類に広く感染する。すべてのIFVは野生水禽のウイルスに由来すると考えられている。しかし、ウイルスが異なる動物種間を伝播する機序が解明されていない.IFVはHA蛋白を介して細胞表面のシアル酸を末端にもつ糖鎖レセプターに結合して感染する。そこで、本研究ではIFVのレセプター特異性と宿主域との関連を解析し、さらに感染実験によってその異動物種間伝播のメカニズムを解明することを目的とした。宿主の細胞表面上にあるレセプターの種類をレクチンを用いて解析した結果、馬、鯨、アザラシの呼吸器にはシアル酸がガラクトースにα2-3結合している糖鎖(α2-3)のみが存在し、豚、フェレットにはα2-3およびα2-6の両者が存在することが判明した。これらの成績はα2-3親和性の鳥IFVが馬に直接伝播可能であるという疫学的知見を裏づける。また、鯨およびアザラシのウイルスが鳥由来ウイルスであるという遺伝子解析結果をも支持する。一方、豚やフェレットでは、α2-6親和性の人ウイルスもα2-3親和性の鳥ウイルスも共に増殖するという以前の感染実験の成績に一致する。一方、人ウイルスから選択された、α2-3親和性変異株のHAのみを有し、他の遺伝子は全て馬のウイルス由来のハイブリッドウイルスを作出した。このウイルスのHAは226番目のアミノ酸がLeuから鳥ウイルスと同じGluに変化していた。しかし、このウイルスは馬では増殖しなかった。さらに228番目のアミノ酸も鳥ウイルスと同じGlyに変化したHAをもつハイブリッドウイルスを作出したところ、馬でよく増殖した。即ち、IFVが馬の気管で増殖するためには226番目に加えて228番目のアミノ酸も重要であることが判明した。現在、このアミノ酸がIFVのレセプター特異性にどのような変化をもたらすのかをレセプター結合試験により解析中である。
著者
見上 彪 松浦 善治 川喜田 正夫 児玉 洋 喜田 宏 永井 美之 小沼 操
出版者
東京大学
雑誌
総合研究(A)
巻号頁・発行日
1990

本研究はニュ-カッスル病ウイルス(NDV)の生態と病原性を総合的に解明することを目的とする。そこで病原性に深く関るNDVのヘモアグルチニンーノイラミニダ-ゼ蛋白(HN)ならびに膜融合蛋白(F)をコ-ドする遺伝子をリコンビナントワクチニアウイルス(rVV),リコビナント鶏痘ウイルス(rFPV)あるいはバキュロウイルス(BV)に捜入し,発現HNあるいはFの生物性状、免疫原性などの検討し,以下の成績を得た。1)。NDVのHNを発現するrVVを作出し,NDV感染防御におけるHNの役割を検討した。8×10^6PFUの生rVVを接種した鶏は,すべて強毒NDVによる致死的に耐過した。一方同量の不活化rVVを接種した鶏は,同様の攻撃により死亡した。攻撃耐過鶏はHNに対する抗体産生が攻撃前あるいは攻撃前あるいは攻撃後に認められたのに対して,非耐過鶏では認められなかった。2)。FPVのチミジンキナ-ゼ遺伝子内にVV由来のプロモ-タ-P.7.5制御下にNDVのHNを発現するrFPVを作出した。このrFPVはNDVのHNに特異的なウイルス中和活性のある単クロ-ン性抗体と反応し,SDSーPAGE上でNDV HNとほぼ同じ移動度を示すHNを産生した。3)。NDV宮寺株のHNをコ-ドする _cDNAを組みこんだBVは感染細胞表面にHNを発現した。このrHNはSDSーPAGE上でNDV感染細胞で発現するHNと同じ移動度を示し,ツニカマイシ処理により,そのアミノ酸配列から予想される分子量とほぼ同じ大きさとなった。4)。NDV F蛋白の全長あるいはC端のアンカ-部位を除いた遺伝子を組み込んだ。これらのうち強毒株由来の全長の遺伝子を発現したもののみ下蛋白の前駆体がF_1F_2サブユニットに解裂し,これらはジスルフィド結合でヘテロダイマ-を形成していた。
著者
喜田 宏 YAMNIKOVA Sv 河岡 義裕 高田 礼人 岡崎 克則 SVETRANA Yam デメネフ V. ヤムニコバ S. ルボフ D.K. 伊藤 壽啓
出版者
北海道大学
雑誌
国際学術研究
巻号頁・発行日
1995

平成7〜9年夏、カムチャッカ半島南端付近、ハバロフスク郊外のアムール河流域ならびにサハ自治共和国内のレナ河流域において水禽の糞便および湖沼水3,000検体を採取した。8年にはレナ河流域北緯63度30分のコベイスキー地区で採取した約900検体の水禽糞便からインフルエンザウイルスH4N6亜型19株、H4N9亜型1株、H11N1亜型1株、H11N6亜型2株、H11N9亜型8株を分離した。9年にはコベイスキー地区で採取した水禽糞便120検体およびヤク-ツク(北緯62度)で採取した鴨の糞便72検体からは各々H4N6亜型1株およびH3N8亜型5株が分離された。一方、レナ河流域北緯65度00分〜64度36分の四十諸鳥地域で採取した水禽糞便約1,400検体と湖沼水20検体からはウイルスが分離されなかった。カムチャッカ半島ならびにアムール河流域で採取した水禽糞便からインフルエンザウイルスは分離されなかった。以上の成績は、鴨の営巣湖沼がレナ河流域北緯63度付近に存在することを示唆する。平成8年と9年の10月に北海道宗谷地方において採取した480検体の水禽糞便材料からインフルエンザウイルスH1N1亜型、H5N3亜型、H5N4亜型、H6N1亜型、H6N7亜型、H8N1亜型、H8N3亜型、H9N2亜型ならびにH11N9亜型各1株を分離した。平成8年度および9年度にレナ河流域および北海道の水禽糞便から分離したインフルエンザウイルスのNP遺伝子の系統進化解析を実施した。その結果、調べた分離株すべてが新型インフルエンザウイルスの発生地である中国南部を含むアジア大陸に分布するウイルスの系統に属することが判明した。以上の成績は、新型インフルエンザウイルスの抗原亜型を予測するために、シベリアの水禽営巣地におけるインフルエンザウイルスの分布をさらに解明する必要があることを示している。
著者
喜田 宏 岡崎 克則 迫田 義博 河岡 義裕 高田 礼人 伊藤 壽啓
出版者
北海道大学
雑誌
基盤研究(A)
巻号頁・発行日
2000

新型ウイルスの亜型予測に資するため、鳥類および動物インフルエンザウイルスの疫学調査を実施した。ロシア、モンゴル、中国および北海道で、渡りカモの糞便3,987検体を採取し、亜型の異なるインフルエンザAウイルス212株を分離した。宮城県のブタからH1N2ウイルスを分離した。北海道大学を含む動物インフルエンザセンター5機関で25株のH9ウイルス株を交換し、解析を共同で開始した。渡りカモのウイルス遺伝子を比較解析したところ、日本で分離されたH9インフルエンザウイルスと1996年に韓国でニワトリに被害をもたらしたウイルスが近縁であった。1995~1999年に中国のニワトリから分離されたH9N2ウイルスの遺伝子解析の結果、渡りカモのウイルスと異なる亜群に分類され、ノイラミニダーゼに欠損が認められた。内部蛋白遺伝子は1997年の香港の強毒H5N1ウイルスに内部蛋白遺伝子を供給したH9N2ウイルスの系統とは異なった。香港のブタ、カスピ海のアザラシの抗体調査を行い、インフルエンザウイルスが感染した成績を得た。インフルエンザウイルスの異種動物間伝播機構を明らかにするため、ニワトリ雛の気嚢継代によって得たニワトリ馴化株の遺伝子再集合体を作出し、ニワトリ肺における増殖性を調べた。HA遺伝子を入れ替えた遺伝子再集合体の増殖性に変化はなく、他の因子が関与することが示唆された。新型ウイルスの出現に備え世界の動物インフルエンザの疫学調査とワクチン候補株を系統保存・管理するプロジェクトをWHOに提案し、各国とのネットワーク形成に支援が得られることになった。
著者
佐藤 文昭 見上 彪 林 正信 喜田 宏 桑原 幹典 小沼 操 遠藤 大二 児玉 洋 久保 周一郎
出版者
北海道大学
雑誌
一般研究(A)
巻号頁・発行日
1987

本研究の主眼は有用な動物用リコンビナント多価ワクチンの作出に必要な基磯実験の実施にある。リコンビナント多価ワクチンはベ-スとなるベクタ-ウイルスとワクチンの決定抗原遺伝子を結合することにより作出される。ベクタ-ウイルスとしてはマレック病ウイルス(MDV)と鶏痘ウイルスに着目し、それらのチミジンキナ-ゼ遺伝子中に挿入部位を設定した。また同時に、MDVの感染から発病の過程に関る種々の抗原遺伝子の解折とクロ-ニングを行った。すなわち、ワクシニアウイルスをベ-スとしてNDVのHN蛋白遺伝子を組み込んだリコンビナントワクシニアウイルスを作出し、NDV感染防御におけるHN蛋白に対する免疫応答が感染防御に重要な役割を果たすことを明かにした。加えて、インフルエンザウイルスおよびニュ-カッスル病ウイルスの感染防御に関る抗原遺伝子の解折により、抗原遺伝子群の変異を検討した。続けて上記のウイルスベクタ-に外来遺伝子を組み込み、リコンビナント多価ワクチン実用化への可能性を検討した。すなわち、ニュ-カッスル病ウイルス(NDV)のヘマグルチニンーノイラミニダ-ゼ蛋白(HN蛋白)とマレック病ウイルスのA抗原の遺伝子をバキュロウイルスベクタ-に組み込み、生物活性と抗原性をほぼ完全に保持した蛋白を得ることができ、ワクチンとしての使用に有望な結果を得た。MDVの単純ヘルペスウイルス(HSV)のB糖蛋白類以蛋白遺伝子をバキュロウイルスベクタ-へ組み込み、高純度の蛋白を得た。さらに、本研究では、将来非常に有用なワクチンを作出するための基磯的な知見とリコンビナント多価ワクチンの実用化を近年中に可能にする実験結果も含むといえる。これらの有用な知見により、本研究は初期の目的を達成したばかりではなく、リコンビナントワクチン実用化への次の目標である野外試験による効用の証明のためにも一助となったといえる。
著者
喜田 宏 清水 悠紀臣 岡部 達二 関川 賢二 見上 彪 笠井 憲雪 小野 悦郎 大塚 治城 喜田 宏
出版者
北海道大学
雑誌
試験研究(A)
巻号頁・発行日
1993

1.オーエスキー病ウイルス(ADV)の前初期(IE)蛋白IE180の機能ドメインを解析した結果、初期および後期遺伝子の転写活性化に関与する領域、IE遺伝子の転写抑制に関与する領域および核への移行シグナルが明らかになった。2. ADVの初期蛋白EP0が感染細胞の核に局在し、IE、初期TKおよび後期gX遺伝子の転写を増強することが明らかになった。この転写増強作用には、EP0分子のN末端に存在するRINGfinger領域が必須であり、酸性アミノ酸を多く含む領域も関与することが判明した。3.蛋白工学手法によって、ADVのIE遺伝子の転写抑制因子を作出した。これら因子の転写調節作用を解析し、以下の成績を得た。1) IE180のDNA結合ドメインとヒト単純ヘルペスウイルスのトランスアクチベータ-VP16の結合ドメインとのキメラ蛋白は、ADVのIE遺伝子の転写を抑制した。このキメラ蛋白はウイルスの増殖を著しく阻害した。2) IE180およびEP0のdominant-negativemutantはウイルスの増殖を抑制した。4.ウイルスの増殖を最も強く抑制した3-1)キメラ蛋白遺伝子をC57BL/6マウス受精卵にマイクロインジェクション法によって導入した。1系統のF1マウスに本遺伝子が導入されたことを確認した。現在、このF1マウスを用いてトランスジェニックマウスの系統を確立しつつある。今後、系統化されたマウスが本遺伝子を発現していることを確認してウイルス感染実験を行う予定である。
著者
喜田 宏
出版者
北海道大学
雑誌
一般研究(B)
巻号頁・発行日
1989

新型インフルエンザウイルスの出現機構に関する我々の仮説を実証し、さらに、今後出現し得る新型ウイルスの抗原亜型の予測に資するため、ウイルス遺伝子を詳細に解析するとともに、豚を用いて感染実験を実施し、以下の成績を得た。1.中国南部の家禽から分離されたH3インフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)の抗原性ならびにその遺伝子を詳細に解析した。得られた成績から、中国南部では家禽が渡り鴨由来ウイルスを豚に伝播する役割を果たしたことが分子生物学的に裏付けられた。2.由来宿主を異にするH3およびH1インフルエンザウイルスに対する豚の感受性をしらべた。実験の結果、豚の呼吸器は豚および人のインフルエンザウイルスのみならず、渡り鴨および家鴨のH3ウイルスにも感受性を示すことが明らかになった。さらに、豚の呼吸器では容易に遺伝子再集合ウイルスが産生されることが実証された。3.H2ーH13HA亜型の鳥類由来インフルエンザウイルスの豚における増殖と抗体応答をしらべた。実験の結果、これまで鳥類のみに分布するとされていた多くの抗原亜型のウイルスが豚に感染し、その呼吸器で増殖することが明らかとなった。またこれらの鳥類由来ウイルスに感染し、鼻汁中にウイルスを排泄した豚の血清はホモのウイルスの血球凝集を阻止しなかったが、明らかな血中抗体応答がELISAによって検出された。以上の成績は何れの抗原亜型のHAをもつウイルスも豚に導入され得ること、ひいては新型ウイルスとして今後人の間に出現する可能性があることを示唆している。また血球凝集阻止試験による血清疫学成績が必ずしも正確な情報を提供しないことが示された。
著者
喜田 宏 梅村 孝司 迫田 義博 伊藤 壽啓 小笠原 一誠 河岡 義裕 岡崎 克則
出版者
北海道大学
雑誌
基盤研究(S)
巻号頁・発行日
2003

本研究は、家禽と家畜のインフルエンザの被害を未然に防ぐとともに、ヒトの新型インフルエンザウイルスの出現に備え、その予防と制圧に資することを目的とする。・動物インフルエンザのグローバルサーベイランスによるウイルス分布の解明2006年秋、日本、モンゴルにおいて採取された渡りガモおよびハクチョウの糞便材料からのウイルス分離を試みた。1,201検体の材料から合計55株のインフルエンザAウイルスを分離同定した。これらの分離株にはH5やH7亜型のインフルエンザウイルスは含まれていなかった。これまでのウイルス分離の成績と合わせると、H1-H16およびN1-N9までの144通りの組合せのうち、133通りのウイルスの系統保存を完了した。・インフルエンザウイルスの病原性決定因子の同定2006年夏、モンゴルの湖沼で死亡野烏が再び発見され、死亡したオオハクチョウおよびホオジロガモの臓器材料からH5N1亜型の高病原性鳥インフルエンザウイルスが分離された。分離されたウイルスは、2005年中国やモンゴルの野生水禽から分離された高病原性のH5N1ウイルスと8つの遺伝子分節すべてが近縁であった。また、このウイルスに対して哺乳動物が高い感受性を示すことが動物試験から明らかにした。・ベッドサイド早期迅速インフルエンザ診断法の開発A型インフルエンザウイルスH5およびH7亜型抗原を特異的に検出する簡易診断キットを開発した。本キットの有用性を実験感染動物の材料を用いて評価したところ、NP検出キットより感度は劣るが、H5およびH7抗原を特異的に検出でき、ベットサイド診断法として有用であることが確認された。